مقايسة لوحة موضعية لتقييم استجابات الإجهاد التأكسدي في السلالات البكتيرية

عالج كل من السلالات البكتيرية غير المنتجة للبيوميلانين والسلالات البكتيرية غير المنتجة للبيوميلانين باستخدام عامل اختبار.

يوفر البيوميلانين ، وهو صبغة خارج الخلية ، الحماية ضد الإجهاد التأكسدي.

يعطل عامل الاختبار التخليق الحيوي للبيوميلانين ، مما يقلل من إنتاجه.

بعد الحضانة ، قم بإجراء تخفيفات بكتيرية متسلسلة باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على عامل الاختبار أو مذيب السيارة.

اكتشف التخفيفات البكتيرية على ألواح أجار بتركيزات متفاوتة من بيروكسيد الهيدروجين — وهو عامل ضغط مؤكسد.

تعمل

الألواح التي تفتقر إلى بيروكسيد الهيدروجين كعناصر تحكم.

حضن. في لوحات التحكم ، تشكل البكتيريا مستعمرات.

في السلالة المنتجة للبيوميلانين غير المعالجة ، يحمي البيوميلانين البكتيريا من الضرر التأكسدي الناجم عن بيروكسيد الهيدروجين ، مما يؤدي إلى مستعمرات مصطبغة.

ومع ذلك ، فإن السلالة المنتجة للبيوميلانين المعالجة بعامل الاختبار ، والتي تظهر انخفاض البيوميلانين ، تصبح حساسة للإجهاد التأكسدي ، مما يؤدي إلى موت البكتيريا.

عد المستعمرات.

يشير انخفاض عدد المستعمرات وحجمها مع زيادة تركيزات بيروكسيد الهيدروجين في السلالات المنتجة للبيوميلانين المعالجة وغير المعالجة وغير المنتجة للبيوميلانين مقارنة بعناصر التحكم إلى زيادة الحساسية البكتيرية للإجهاد التأكسدي.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد مزارع ليلية للسلالات ليتم اختبارها في LB ، مع وبدون NTBC. في اليوم التالي ، قم بإعداد ألواح أجار LB التي تحتوي على بيروكسيد الهيدروجين كضغط مؤكسد. أولا ، قم بإذابة قوارير أجار LB وتبريد الوسائط إلى حوالي 50 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف بيروكسيد الهيدروجين مباشرة إلى الوسائط المبردة بالتركيزات المطلوبة. حرك القارورة للخلط. يعد نطاق تركيزات بيروكسيد الهيدروجين من 0 إلى 1 ملليمولار نقطة انطلاق جيدة. صب الأطباق على الفور ، وقم بإشعال السطح لإزالة الفقاعات. العائد هو أربع صفائح لكل 100 ملم من أجار LB. ضع علامة على الصفائح بتركيز بيروكسيد الهيدروجين.

ضع الألواح مكشوفة في غطاء تدفق بيولوجي ، مع تشغيل المروحة لمدة 30 دقيقة لإزالة الرطوبة الزائدة من الألواح. يجب استخدام الأطباق في نفس يوم تحضيرها. أثناء تجفيف الألواح ، اغسل وقم بقياس OD600 من الثقافات الليلية.

تطبيع OD600 لجميع المزارع الليلية إلى أدنى قيمة لمجموعة السلالات التي يتم اختبارها. للقيام بذلك ، حدد حجم الثقافة اللازمة لتخفيف الثقافة إلى أدنى OD600 في حجم إجمالي قدره 1 ملليلتر.

على سبيل المثال، إذا كانت المزرعة تحتوي على OD600 من 3 وأدنى OD600 لمجموعة السلالات هو 2.5، فقم بإجراء الحساب التالي، والذي سينتج عنه 0.833 ملليلتر كحجم المزرعة المطلوب. ضع 0.833 مل من المزرعة في أنبوب ميكروفوج. بعد ذلك ، احسب كمية LB بالإضافة إلى NTBC أو LB بالإضافة إلى DMSO اللازمة لرفع حجم الثقافة إلى 1 ملليلتر. في هذا المثال ، ستكون الكمية 0.167 ملليلتر. تخلط عن طريق الدوامة.

للحفاظ على الثقافات في تركيز ثابت من NTBC أو DMSO ، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف للثقافات الليلية الطبيعية في PBS بالإضافة إلى NTBC أو PBS بالإضافة إلى DMSO. قم بعمل حلول مخزون من PBS بالإضافة إلى NTBC و PBS بالإضافة إلى DMSO لأعلى أو لأسفل ، اعتمادا على عدد السلالات التي يتم اختبارها.

بالنسبة لمجموعة واحدة من التخفيفات لسلالة واحدة ، امزج 300 ميكرومولار من NTBC أو حجم مكافئ من DMSO مع PBS للحصول على حجم إجمالي قدره 720 ميكرولترا. أضف 90 ميكرولترا من PBS بالإضافة إلى NTBC أو PBS بالإضافة إلى DMSO إلى أنابيب الطرد الدقيق المناسبة المسماة من 10 إلى سالب 1 إلى 10 إلى سالب 7 التخفيفات التسلسلية. أضف 10 ميكرولتر من الثقافة إلى 10 إلى أنبوب التخفيف ناقص 1.

امزج عن طريق الدوامة ، وانقل 10 ميكرولتر من 10 إلى ناقص 1 التخفيف إلى 10 إلى أنبوب التخفيف ناقص 2. قم بتغيير أطراف الماصة بين التخفيفات، كرر العملية حتى يتم إجراء جميع عمليات التخفيف.

ضع 5 ميكرولترات من 10 إلى سالب 3 إلى 10 إلى سالب 7 تخفيفات على LB بالإضافة إلى ألواح بيروكسيد الهيدروجين في نسختين لكل سلالة. استخدم طرف ماصة واحدا إذا كانت البقع مطلية لمعظمها مخفف إلى أقل تخفيفا. لا تقلب اللوحة أو تميل حتى يجف السائل في الطبق. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية. لمدة 24 إلى 48 ساعة ، حسب السلالة. بمجرد ظهور مستعمرات جيدة الحجم ، قم بتصوير اللوحات باستخدام كاميرا CCD فوق مصباح الإضاءة.