موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 6:41 دقيقة • July 8th, 2025
خذ صفيحة ميكروتيتر بغطاء يتميز بدعامات أسطوانية أو أوتاد مطلية بأغشية حيوية بكتيرية.
ضع غطاء الوتد المطلي بالأغشية الحيوية على آبار صفيحة ميكروتيتر مع مخزن مؤقت للقضاء على البكتيريا غير المرتبطة أو العوالق ، مع التركيز على القياسات المرتبطة بالأغشية الحيوية.
انقل غطاء الوتد المغطى بالأغشية الحيوية المغسول إلى لوحة تحدي مع زيادة تركيزات العامل المضاد للبكتيريا في الاختبار. احتضان دون اهتزاز.
اعتمادا على تركيز العامل وإمكاناته المضادة للبكتيريا ، فإنه يعطل نشاط التمثيل الغذائي البكتيري وسلامة الأغشية الحيوية.
بعد الحضانة ، ضع غطاء الوتد على آبار صفيحة تحتوي على عازلة لإزالة بكتيريا العوالق.
انقله إلى آبار صفيحة ميكروتيتر مع وسيط استعادة الأغشية الحيوية الذي يحتوي على ريزازورين ، وهو صبغة فلورية ضعيفة نفاذية للخلية. حضن.
في البكتيريا النشطة الأيضية ، تقلل إنزيمات نازعة الهيدروجين من الريزازورين الأزرق اللون إلى ريسوروفين فلوري وردي اللون.
يشيرنقص تحويل الريزازورين إلى استئصال الأغشية الحيوية ، بينما يشير التحويل إلى ريسوروفين إلى وجود خلايا قابلة للحياة.
يشيرأدنى تركيز للعامل المضاد للبكتيريا في الاختبار الذي لا ينتج عنه تحويل ريزازورين إلى الحد الأدنى من تركيز القضاء على الأغشية الحيوية.
خذ طبقا جديدا من 96 بئرا ، وأضف 100 ميكرولتر من CRPMI متوازنا لدرجة حرارة الغرفة إلى كل بئر من الصفوف B إلى H. خفف ما يصل إلى أربعة مركبات اختبار بشكل منفصل في 1.0 ملليلتر من CRPMI إلى 2x التركيز النهائي المطلوب. أضف 200 ميكرولتر من المركب الأول في الآبار A1 إلى A3 ، و 200 ميكرولتر من المركب الثاني في الآبار A4 إلى A6 ، و 200 ميكرولتر من المركب الثالث في الآبار A7 إلى A9 ، و 200 ميكرولتر من المركب الرابع في الآبار A10 إلى A12.
قم بتخفيف مركبات الاختبار بشكل متسلسل باستخدام ماصة متعددة القنوات. ابدأ بنقل 100 ميكرولتر من الصف A إلى الصف B ، واخلطها. بهذه الطريقة ، استمر في نقل 100 ميكرولتر جيدا إلى البئر. امزج بعد كل نقل وتوقف في الصف F. بعد الخلط ، طرد 100 ميكرولتر من الصف F في حاوية النفايات. لا تنقل أي سائل إلى الصفين G و H. أخيرا، أضف 100 ميكرولتر من CRPMI إلى كل بئر من اللوحة باستخدام ماصة متعددة القنوات، ليصل الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر.
أضف 200 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات إلى صفيحة جديدة معقمة مكونة من 96 بئرا تتميز بآبار بأبعاد مماثلة لتلك الموجودة في لوحة بدء الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، قم بإزالة الكيس البلاستيكي وفيلم البارافين من لوحة بدء الأغشية الحيوية المحتضنة. ارفع الغطاء بشكل مستقيم لأعلى ، وتجنب ملامسة الأوتاد وأسفل اللوحة لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف الأغشية الحيوية. احتفظ بالجزء السفلي لتحليل OD600 اللاحق.
اشطف الخلايا العوالق عن طريق وضع غطاء الوتد على اللوحة التي تحتوي على PBS. اغمر الأوتاد لمدة 5 ثوان ، وارفعها من PBS ، واغمرها مرة أخرى ، مع الحرص على عدم الاصطدام بالأوتاد على جوانب البئر. ضع غطاء الوتد المغسول في لوحة التحدي. تجنب التلامس غير الضروري بين الأوتاد واللوحة السفلية ، لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف الأغشية الحيوية مما يؤدي إلى نتائج غير متسقة.
أغلق اللوحة بغشاء البارافين ، وضعها في كيس بلاستيكي قابل للغلق كما كان من قبل. احتضان اللوحة دون رجها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. خذ الجزء السفلي من لوحة بدء الأغشية الحيوية وأعد تعليق البكتيريا في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بقياس OD600 باستخدام قارئ صفيحة دقيقة مناسب لتأكيد النمو الذي يحدث في جميع الآبار ، ولكن ضوابط العقم في الصف H.
استخدم قارئ لوحة مجهز بغرفة حضانة ، وقادر على أخذ قراءات مضان حركية للكشف عن تحويل الريزازورين. قم بإعداد قياس مضان حركي على مدار 24 ساعة باستخدام إثارة 530 نانومتر وانبعاث 590 نانومتر. اضبط درجة حرارة الغرفة على 37 درجة مئوية واجعل اللوحة تقرأ كل 20 دقيقة.
اضبط قارئ اللوحة للقياس من أسفل اللوحة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استعد لغسل اللوحة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر من صفيحة معقمة ذات 96 بئرا مع ماصة متعددة القنوات. بعد ذلك ، قم بإعداد وسيط استعادة الأغشية الحيوية عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من 0.8 ملليغرام لكل مليلتر من محلول مخزون ريزازورين إلى 20 مل من وسط CRPMI ، إلى تركيز نهائي قدره 16 ميكروغرام لكل مليلتر ريزازورين.
بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من وسط استعادة الأغشية الحيوية باستخدام ماصة متعددة القنوات ، إلى كل بئر من صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا. انقل لوحة التحدي من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، وقم بإزالة الكيس البلاستيكي وفيلم الختم بعناية. قم بإزالة غطاء الوتد من لوحة التحدي واشطف خلايا العوالق في PBS كما كان من قبل ، مع الاحتفاظ بالجزء السفلي من لوحة التحدي لتحليل OD600 اللاحق.
بعد الشطف ، ضع غطاء الوتد في قاع اللوحة الذي يحتوي على وسط استعادة الأغشية الحيوية. لف جانب اللوحة بغشاء البارافين ، مع الحرص على عدم إعاقة قاع الآبار المحيطة. مباشرة بعد لف اللوحة ، ضعها على قارئ اللوحة ، وابدأ قراءة حركية على مدار 24 ساعة عن طريق بدء بروتوكول ريزازورين الحركي الذي تم إنشاؤه مسبقا.