اختبار قائم على التألق في المختبر لقياس كفاءة إعادة ختم غشاء البلازما

خذ صفيحة دقيقة تحتوي على خلايا الثدييات على الجليد.

أضف وسيطا يحتوي على الكالسيوم إلى الآبار المختارة ووسطا بدون كالسيوم للآبار الأخرى.

أدخل مونومرات من السم البكتيري المكون. تمنع درجة الحرارة المنخفضة تراكم المونومر ، مما يسهل الارتباط بكوليسترول غشاء الخلية.

احتضان عند درجة حرارة فسيولوجية ، مما يسمح للمونومرات المرتبطة بالكوليسترول بالقلة قليلة وإدخالها في الغشاء ، وتشكيل مسام.

في الآبار التي تحتوي على الكالسيوم خارج الخلية ، تسبب المسام تدفق الكالسيوم.

يؤدي

التدفق إلى تساقط السم الخارجي وإعادة إغلاق الغشاء.

تؤدي زيادة الكالسيوم داخل الخلايا أيضا إلى إفراز الخلايا الليزوزومي ، مما يؤدي إلى إطلاق إنزيم يحول سفينغومايلين الغشاء إلى سيراميد.

يؤدي

الغشاء الغني بالسيراميد إلى الالتقام الخلوي السمي ، مما يعيد إغلاق الغشاء.

يتم إعاقة إعادة إغلاق الغشاء في الآبار التي لا تحتوي على الكالسيوم خارج الخلية.

أضف يوديد البروبيديوم أو PI - صبغة فلورية - لا يمكنها دخول الخلايا بغشاء تم إصلاحه ولكنها تدخل الخلايا التالفة لربط الحمض النووي ، مما ينبعث منها مضانة.

قم بقياس التألق على فترات زمنية محددة لتقييم كفاءة إعادة إغلاق الغشاء.

لإعداد اختبار قائم على التألق عالي الإنتاجية لظروف الإصلاح المسموح بها ، اغسل الخلايا مرتين ب 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية M1 متوسطة لكل بئر ، وأضف 100 ميكرولتر من الوسط الطازج 37 درجة مئوية M1 المكمل بيوديد بروبيديوم 30 ميكرومولار بعد التخلص من الغسيل الثاني.

لظروف الإصلاح المقيدة ، اغسل الخلايا مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية M2 متوسطة مكملة ب 5 ملليمولار EGTA لكل بئر ، متبوعا بغسل واحد مع 200 ميكرولتر من وسط M2 وحده.

بعد التخلص من الغسيل الثاني ، أضف 100 ميكرولتر من متوسط M2 الطازج 37 درجة مئوية مع 30 ميكرومولار بروبيديد يوديد لكل بئر. بعد ذلك ، قم بتصوير اللوحة تحت الضوء المرسل ، GFP ، و PI ، كما هو موضح للتو. أثناء تصوير اللوحة ، ضع صفيحة بولي بروبلين مستديرة القاع 96 بئرا على الجليد ، وقم بتكوين اللوحة كما هو موضح للتو في اللوحة السابقة.

لإصلاح الظروف المتساهلة ، أضف 100 ميكرولتر من وسط M1 المثلج المكمل ب 60 ميكرومولار من يوديد البروبيديوم لكل بئر ، متبوعا بإضافة 100 ميكرولتر من M1 المثلج مع أو بدون 4x listeriolysin O لكل بئر.

لظروف الإصلاح المقيدة ، أضف 100 ميكرولتر من وسط M2 المثلج المكمل ب 60 ميكرومولار يوديد البروبيديوم لكل بئر ، متبوعا بإضافة 100 ميكرولتر من M2 المثلج مع أو بدون 4x listeriolysin O لكل بئر.

من الضروري تحضير الليستيريوليسين O بالتركيز التجريبي المناسب على الجليد قبل 5 دقائق تقريبا من بدء الفحص الحركي عندما تكون اللوحة 1 على الجليد ويتم تحضير اللوحة 2.

عند الانتهاء من التصوير الأول ، انقل اللوحة على الفور إلى لوح من رقائق الألومنيوم على الجليد. بعد 5 دقائق ، انقل 100 ميكرولتر من كل بئر من اللوحة الثانية إلى البئر المقابل المناسب في اللوحة المبردة الأولى ، وأدخل أطراف الماصة أسفل الغضروف المفصلي للمحلول في كل بئر قبل إخراج الحجم دون الخلط للتوزيع الصحيح للسم.

اسمح للسم بالارتباط بالخلايا المضيفة لمدة 1 دقيقة ، وانقل اللوحة الأولى على الفور إلى قارئ اللوحة لاختبار ما بعد الحركة باستخدام وضع مقياس الطيف الفلوري. في نهاية الفحص الحركي ، احصل على الفور على تصوير ما بعد الحركية لصورة اللوحة كما هو موضح في التصوير الحركي.