تلطيخ الكيمياء المناعية للكشف عن مستضدات فيروس داء

ابدأ بشريحة تحمل قسم أنسجة دماغ الفأر المصاب بفيروس داء المثبت بالفورمالين والبارافين. يحتفظ القسم الثابت بالمستضدات الفيروسية عن طريق الربط المتقاطع للبروتين.

عالج الشريحة بمحلول زيلين لإزالة البارافين.

اغمر الشريحة في انخفاض تركيزات الإيثانول لترطيب الأنسجة ، مما يجعلها متوافقة مع المحاليل المائية.

إدخال مخزن مؤقت يحتوي على البروتياز لتعطيل الروابط المتقاطعة للبروتين ، وتحسين إمكانية الوصول إلى المستضد.

اغمر في بيروكسيد الهيدروجين لمنع البيروكسيديز الداخلي ، وتطبيق محلول مانع لمنع التفاعلات غير المحددة.

إدخال الأجسام المضادة الأولية الخاصة بمستضد داء ، وتشكيل مجمعات الأجسام المضادة للمستضد.

أضف الأجسام المضادة الثانوية البيوتينيل ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية. احتضان مع إنزيمات بيروكسيداز المترافقة مع الستربتافيدين, التي تتفاعل مع البيوتين.

أدخل ركيزة بيروكسيداز ، تنتج راسب أرجواني أحمر.

قم بتلطيخ الأنسجة ببقعة نووية ، متبوعا بعامل زرقاء ، مما يؤدي إلى تلطيخ النوى باللون الأزرق.

تكشف صورة الكيمياء المناعية عن بقع حمراء أرجوانية في السيتوبلازم ، مما يؤكد وجود مستضدات داء في قسم الأنسجة.

باستخدام ميكروتوم ، اصنع قسما من البارافين بحجم 5 ميكرومتر. قم بتعويم القسم على حمام مائي عند 38 درجة مئوية ، واجمعه على شرائح زجاجية. قم بتسمية الشرائح بقلم مقاوم للكاشف. ضعي الشرائح في صينية ، وذوبيها في فرن على حرارة 55 إلى 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الشرائح من الفرن ، وقم بإزالة البارافينات منها على الفور باستخدام ثلاث شطفات متتالية من الزيلين مدة كل منها خمس دقائق. بعد ذلك ، أعد ترطيب الأقسام الموجودة على الشريحة عن طريق الغمر المتسلسل في تقليل تخفيفات الإيثانول إلى الماء منزوع الأيونات ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

عالج الشرائح بالبروتياز لمدة 30 دقيقة لاسترجاع المستضد المحلل للبروتين ، ثم اشطف الشرائح في PBST لمدة 10 دقائق ، وعالجها ببيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرة أخرى باستخدام PBST لمدة 10 دقائق.

للبدء ، قم بإزالة شريحة واحدة من المخزن المؤقت ، وتأكد من التعامل مع شريحة واحدة فقط في كل مرة ، بينما تظل الشرائح الأخرى مغمورة ، واستخدم منشفة ورقية لمسح المخزن المؤقت الزائد من حول قسم الأنسجة. ضع الشرائح في غرفة الرطوبة ، واحتضنها بمصل الماعز العادي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة مع الأجسام المضادة الأولية المضادة لداء والأجسام المضادة للتحكم السلبية المحددة مسبقا في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة دون غسلة بينهما. بعد ذلك ، اغسل الشرائح باستخدام PBST لمدة 10 دقائق ، واحتضن في غرفة الرطوبة مع الجسم المضاد البيوتينيل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

اغسل الشرائح مرة أخرى باستخدام PBST لمدة 10 دقائق. احتضن الشرائح في غرفة الرطوبة باستخدام مركب الستربتافيدين-HRP في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، واغسل PBST لمدة 10 دقائق. ثم احتضن مع AEC في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق وقم بإزالة البقع باستخدام هيماتوكسيلين جيل المخفف من 1 إلى 2 بالماء منزوع الأيونات لمدة دقيقتين.

بعد ذلك ، اشطف الهيماتوكسيلين الزائد عن طريق غمس الشرائح بالماء منزوع الأيونات. اشطف الشرائح في ماء الصنبور الخاص بسكوت لمدة 30 ثانية ، واغسلها بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الشرائح واحدة تلو الأخرى وقم بتثبيتها بوسيط تثبيت قابل للذوبان في الماء. ثم استخدم مجهر ضوئي لقراءة الشرائح.