طريقة تهطيب مناعي متشابكة محسنة للتحديد الفعال للحمض النووي الريبي المرتبط بالبروتين في خصيتي الفئران

0 views • 5:07 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خذ خصية الفأر التي تم حصادها حديثا في مخزن مؤقت مبرد. قم بإزالة الغلالة البيضاء ، طبقة الأنسجة الليفية.

ثلاثي الخصية لإطلاق الأنابيب المنوية التي تحتوي على الخلايا الجرثومية وخلايا سيرتولي.

أضف عازلة وأخضع الأنابيب للأشعة فوق البنفسجية من أجل التشابك غير القابل للانقطاع للحمض النووي الريبي مع البروتينات المرتبطة ، مع الحفاظ على التفاعلات.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الأنابيب في مخزن مؤقت للتحلل يحتوي على مثبطات RNase والبروتياز.

صوتنة الأنسجة ، وإطلاق مجمعات البروتين والحمض النووي الريبي والمكونات الأخرى داخل الخلايا. تعمل مثبطات RNase والبروتياز على تعطيل RNases والبروتياز

الذاتية.

أضف DNase لتحلل الحمض النووي. إدخال RNase المخفف لهضم الحمض النووي الريبي الجزئي.

جهاز الطرد المركزي ونقل المادة الطافية التي تحتوي على مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي إلى محلول حبة مغناطيسية مطلي بالأجسام المضادة مع خصوصية عالية للبروتين المستهدف المرتبط بالحمض النووي الريبي.

تطبيق مجال مغناطيسي لفصل مجمعات البروتين والحمض النووي الريبي المرتبطة بالخرزة. تخلص من المادة الطافية.

يغسل مع العازلة. افصل مغناطيسيا بين مجمعات البروتين والحمض النووي الريبي واستخدمها لمزيد من تحليل تفاعل الحمض النووي الريبي والبروتين.

لبدء هذا الإجراء ، احصد حوالي 100 ملليغرام من الخصيتين من الفئران في العمر المناسب لكل تجربة ترسيب مناعي. ضع المناديل في PBS المثلج. باستخدام زوج من الملقط ذو الأطراف الدقيقة ، قم بإزالة الغلالة البرية برفق. أضف 3 ملليلتر من PBS المثلج إلى مطحنة الأنسجة ، واستخدم مدقة زجاجية فضفاضة لترثيل الأنسجة بقوة ميكانيكية خفيفة. بعد ذلك ، انقل تعليق الأنسجة إلى طبق زراعة الخلايا ، وأضف PBS المثلج حتى 6 ملليلتر. رج الطبق بسرعة حتى يغطي السائل قاع الطبق بالتساوي.

قم

بربط المعلق على الجليد ثلاث مرات ب 400 مللي جول لكل سنتيمتر مربع عند 254 نانومتر. تأكد من خلط التعليق بين كل إشعاع ، ثم اجمع التعليق في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 1,200 مرة جم وعند 4 درجات لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من PBS. بعد ذلك ، انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 1,000 مرة جم وعند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين وتخلص من المادة الطافية.

أولا ، أضف 125 ميكرولترا من حبات البروتين A المغناطيسية لكل عينة إلى أنبوب طرد مركزي جديد. ضع الأنبوب على المغناطيس لفصل الخرز عن المحلول. بعد 10 ثوان ، قم بإزالة المادة الطافية ، واغسل الخرزات مرتين باستخدام 1 مليلتر من محلول التحلل المثلج. أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل البارد مع 10 ميكروغرام من الجسم المضاد eCLIP. قم بتدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة ، ثم اغسل الخرزات مرتين باستخدام 1 ملليلتر من محلول التحلل المثلج.

للبدء ، قم بتعليق كريات الأنسجة في 1 مليلتر من محلول التحلل البارد الذي يحتوي على 22 ميكرولتر من كوكتيل مثبط البروتين الخالي من 50X EDTA و 11 ميكرولتر من مثبط RNAse. استمر في لحل العينات على الثلج لمدة 15 دقيقة. يتم توضيح كل عينة في بروتوكول النص. بعد ذلك ، أضف 4 ميكرولتر من الحمض النووي إلى كل أنبوب واخلطه جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أثناء الاهتزاز بسرعة 1,200 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من RNAse المخفف واخلط جيدا. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أثناء الاهتزاز بسرعة 1,200 دورة في الدقيقة.

ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 15,000 مرة جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لمسح المحلل. اجمع المادة الطافية بعناية. أولا ، أضف 1 مليلتر من المحللة إلى الخرزات المحضرة وقم بتدوير العينات عند 4 درجات مئوية إما لمدة ساعتين أو طوال الليل. بعد ذلك ، اجمع الخرزات بالحامل المغناطيسي وتخلص من المادة الطافية. اغسل الخرزات مرتين باستخدام 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت عالي الملح ، ثم اغسل الخرزات مرتين باستخدام 900 ميكرولتر من محلول الغسيل.

10:05

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

Related Videos

0 Views

09:40

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Related Videos

0 Views

09:26

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

Related Videos

0 Views

13:00

سريع سرعة عالية طريقة لرسم الخرائط Ribonucleoproteins (RNPs) على مرنا ما قبل الإنسان

Related Videos

0 Views

13:34

طريقة لعزل وتحديد من microRNAs، وmRNAs ومكونات البروتين من بروتين نووي ريبوزي مجمعات من مقتطفات خلية باستخدام رقاقة RIP

Related Videos

0 Views

11:19

رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

Related Videos

0 Views

10:52

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Related Videos

0 Views

09:45

إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة

Related Videos

0 Views

10:31

طريقه الربط المحسنة لايمونوبريسيبيتيشن (eCLIP) للتعرف الفعال علي الحمض الريبي المرتبط بالبروتين في خصيه الماوس

Related Videos

0 Views

08:46

نسخ على نطاق التنميط من البروتين RNA التفاعلات من خلال ربط عبر والمناعة بوساطة العلم Biotin تنقية جنبا إلى جنب

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026