موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 6:20 دقيقة • July 8th, 2025
خذ خلايا الأعضاء اللمفاوية الثانوية من فأر محصن بالمستضد ، يحتوي على خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد في مراحل دورة الخلية المختلفة.
G1 و S و G2 و M هي مراحل من الخلايا المنقسمة بنشاط ، في حين أن الخلايا في مرحلة G0 هادئة.
أضف صبغة الفلورسنت القابلة للحياة لتسمية الخلايا الميتة ، والأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور ترتبط بعلامات سطح الخلايا التائية CD3 و CD8.
إدخال معددا من الببتيد المستضد المترافق بالفلوروفور - معقد التوافق النسيجي الكبير لربط مستقبلات الخلايا التائية ، ووضع علامات على الخلايا التائية الخاصة بالمستضد.
باستخدام مخزن مؤقت ، قم بإصلاح الخلايا ونفاذها.
أدخل الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور لربط البروتين النووي المرتبط بتكاثر الخلايا - تلطيخ الخلايا المنقسمة بنشاط.
أضف بقعة فلورية إلى تسمية الحمض النووي.
باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حدد الخلايا الحية وحدد خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد عبر الملصقات المرتبطة بالسطح.
تميزشدة صبغة الحمض النووي خلايا G0 و G1 بكمية أقل من الحمض النووي من خلايا S و G2 و M ذات كمية الحمض النووي الأعلى. يؤدي غياب الجسم المضاد الخاص بالبروتين النووي إلى فصل خلايا G0.
قم بإعداد مخزن غسيل نفاذية طازج 1X عن طريق تخفيف عازلة نفاذية 10X بالماء المقطر ، وقم بتصفيته من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر للتخلص من الركام. تمييع الجسم المضاد أحادي النسيلة Ki67-FITC في مخزن غسيل نفاذية 1X كما هو محدد من خلال تجربة المعايرة بالحجم النهائي 100 ميكرولتر لكل عينة.
أضف 3 ملليلتر من مخزن غسيل النفاذية 1X إلى كل أنبوب به خلايا وجهاز طرد مركزي عند 400 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية. مرة أخرى ، أضف المخزن المؤقت لغسيل النفاذية 1X وجهاز الطرد المركزي لحبيبات الخلايا ، ثم تخلص من المادة الطافية.
أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة المخفف Ki67-FITC إلى الحبيبات ، ثم قم بدوامة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين ب 4 ملليلتر من عازلة النفاذية 1X ، والطرد المركزي بعد كل غسلة ، وتخلص من المادة الطافية.
أضف 350 ميكرولترا من PBS إلى حبيبات الخلية للحصول على عينات مباشرة من مقياس التدفق الخلوي ، و 250 ميكرولترا من PBS إلى حبيبات الخلية للعينات التي سيتم تحضينها باستخدام Hoechst لتلوين الحمض النووي. قم بإعداد محلول Hoechst و PBS وأضفه إلى كل عينة ، بحيث يكون التركيز النهائي 2 ميكروغرام لكل ملليلتر. دوامة واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في الظلام. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 5 دقائق وأضف 350 ميكرولتر من PBS إلى حبيبات الخلية.
افتح البرنامج وأنشئ مجموعات مختلفة تتوافق مع الأجهزة المختلفة المراد تحليلها بالنقر فوق إنشاء مجموعة في قسم شريط مساحة العمل. افتح نافذة تعديل المجموعة بالنقر المزدوج على اسم المجموعة ومزامنة المجموعات التي تم إنشاؤها حديثا عن طريق إدراج علامة اختيار على الدالة متزامنة.
اسحب كل ملف FCS إلى المجموعة المقابلة له ، ثم قم بإنشاء استراتيجية بوابة تبدأ بمجموعة LN من خلال مجموعة LN. افتح نافذة الرسم البياني بالنقر المزدوج على العينة الملطخة بالكامل لعرض الأحداث غير المكتسبة لهذه العينة في مخطط نقطي. لاحظ أن المحور x و y تم تصنيفهما كما هو الحال في ملفات FCS ، كما هو موضح في الجدول 2 من ملف إعدادات مقياس التدفق الخلوي لهذه المخطوطة. تحقق من عرض عدد كاف من الأحداث للتصور المناسب.
إذا لزم الأمر ، افتح التفضيلات بالنقر فوق رمز القلب في شريط مساحة العمل ، وحدد الرسوم البيانية ، ثم رسم النقطة كنوع الرسم البياني ، وتحقق من صحة عدد النقاط المرسومة في المربع المقابل أو قم بتغييره. اعرض الأحداث غير المألوفة في نافذة الرسم البياني في مخطط نقطي مع DNA-A على المحور x و DNA-W على المحور y. استخدم المقياس الخطي لكلا المحورين. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير المقياس من اللوغاريتمي إلى الخطي بالنقر فوق المربع المشار إليه بحرف T بالقرب من كل محور في نافذة الرسم البياني.
حدد مجموعة خلية واحدة بالنقر فوق مستطيل في قسم أدوات البوابات ، ثم انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة المستطيلة لعرض الخلايا المفردة في مخطط نقطي مع معلمة FSC-A على المحور x وصبغة الخلايا الميتة على المحور y.
انقر فوق المضلع لتحديد عدد الخلايا الحية ، والتي تكون سالبة لصبغة الخلايا الميتة. انقر نقرا مزدوجا في وسط بوابة المضلع لعرض الخلايا في مخطط نقطي باستخدام المعلمة FSC-A على المحور x والمعلمة SSC-A على المحور y.
انقر فوق مستطيل وقم بإنشاء بوابة "مريحة" لتضمين جميع الخلايا الحية الفردية في هذا الرسم البياني. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة المريحة لعرض الخلايا في مخطط نقطي مع CD3 على المحور x و CD8 على المحور y.
استخدم مقياس المحور المناسب للتصور في نافذة الرسم البياني. إذا لزم الأمر ، قم بتعديل مقياس x و y بالنقر فوق المربع المشار إليه بحرف T بالقرب من كل محور. اختر تخصيص وظيفة المحور وقم بتعديل عقود Extra Neg وأساس العرض والعقود الإيجابية حسب الضرورة.
حدد الخلايا الإيجابية CD3 وCD8 الإيجابية بالنقر فوق المضلع. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة الموجبة ل CD3 وإيجابية CD8 لعرض الخلايا في مخطط نقطي مع Tetr-gag على المحور x و Pent-gag على المحور y. حدد خلايا CD8 T الخاصة بالمستضد بالنقر فوق Polygon. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة الخاصة بكمامة الأفواة لعرض الخلايا في مخطط نقطي مع DNA-A على المحور x و Ki67 على المحور y. حدد الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة بالنقر فوق رباعية في قسم أدوات البوابات في نافذة الرسم البياني.