مقايسة قياس التدفق الخلوي لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا المناعية في خلايا الدم المحيطية أحادية النواة

خذ خلايا الدم المحيطية أحادية النواة أو PBMCs ، وهي مجموعة من الخلايا المختلطة بما في ذلك الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة.

أضف صبغة الفلورسنت القابلة للحياة للتمييز بين الخلايا الميتة ، وكوكتيل الأجسام المضادة المسمى بالفلورسنت لتحديد أنواع الخلايا المختلفة.

ترتبط الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم A بعلامات السطح - CD3 على الخلايا التائية ، ومستقبلات الخلايا التائية γδ أو TCR على الخلايا التائية γδ ، و CD56 على الخلايا القاتلة الطبيعية أو الخلايا القاتلة الطبيعية.

ترتبط الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم B ب CD4 و CD8 على الخلايا التائية ، و CD19 على الخلايا البائية ، و CD14 على الخلايا الوحيدة.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حدد المجموعات الفرعية للخلايا الحية.

في حين أن خلايا CD8 ⁺ و CD4 ⁺ T هي خلايا CD3 ⁺ ، تقع خلايا CD4 ⁺ بين خلايا CD3 موجبة مفردة و CD3-CD8 مزدوجة الإيجابية.

γδ تعبر الخلايا التائية عن γδ TCRs و CD3 أعلى مقارنة بخلايا CD4 ⁺ و CD8 ⁺.

الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية هي CD3^- ولكن يتم تحديدها بواسطة CD19 على الخلايا البائية و CD56 على الخلايا القاتلة الطبيعية.

يتم تحديد الخلايا الوحيدة بواسطة تعبير CD14.

لتحضير PBMCs للتلوين ، انقل 100 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة قاع على شكل حرف V سعة 96 بئرا. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 350 مرة جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعناية ، استنشق المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. إلى كل بئر ، أضف 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على صبغة حية / ميتة قابلة للإصلاح تتفاعل مع الأمين الحر على البروتينات ، وأعد تعليق خليط PBMC بعناية.

بعد ذلك ، اترك اللوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لوضع العلامات على الخلايا الميتة. لكل عينة ، قم بإعداد 30 ميكرولترا من مزيج يحتوي على جميع الأجسام المضادة السبعة. في هذه المرحلة ، يمكن أيضا إضافة الأجسام المضادة المعيرة ضد جزيئات مستهدفة مختلفة وفي فلوروكرومات مختلفة. الطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 350 مرة جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية.

أضف كوكتيل الأجسام المضادة إلى كل بئر ، وأعد تعليقه بعناية دون توليد فقاعات. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد 30 دقيقة ، أضف 150 ميكرولترا من مخزن التلوين إلى كل بئر ، وقم بالطرد المركزي للوحة عند 350 مرة جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية ، وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS. الخلايا جاهزة الآن لتحليل قياس التدفق الخلوي.

لبدء استراتيجية البوابات ثنائية الفلوروكروم ، سبع علامات ، حدد بوابة الخلايا الليمفاوية وقم بإنشاء مخطط نقطي مع أحد الفلوروكرومين المستخدمين في هذا البروتوكول على كل محور. بوابة على الخلايا التائية الموجبة CD8 ، والتي تم تحديدها على أنها خلايا CD3 و CD8 موجبة مزدوجة في الزاوية العلوية اليمنى من المخطط النقطي. استبعاد مجموعة CD8 الخافتة، التي قد تحتوي على خلايا NK T. بوابة على الخلايا التائية الإيجابية CD4 ، التي تم تحديدها على أنها السكان بين الخلايا التائية الإيجابية CD8 ومجموعات CD3 المفردة الإيجابية.

بوابة على خلايا جاما دلتا التائية ، تم تحديدها على أنها خلايا CD3 عالية. قسم خلايا جاما دلتا التائية إلى CD8 إيجابية و CD8 سلبية. بوابة على الخلايا القاتلة الطبيعية ، تم تحديدها على أنها السكان بين الخلايا الإيجابية CD3 و CD3 السلبية. قسم خلايا NK إلى بوابة إيجابية CD8 وسالبة CD8 على الخلايا البائية ، والتي تم تحديدها على أنها مجموعة CD3 سلبية وإيجابية CD19 في الزاوية اليمنى السفلية من المخطط النقطي.

حدد بوابة الخلية الأحادية وقم بإنشاء مخطط نقطي بأحد الفلوروكرومين المستخدمين في هذا البروتوكول على كل محور. بوابة على السكان السلبيين CD3 ، CD14.