استخدام مجسات التوتر القائمة على الحمض النووي لتقييم قوى المستقبلات التي تطبقها الخلايا المناعية

ابدأ بغطاء زجاجي وظيفي مع جزيئات الذهب النانوية المثبتة على البولي إيثيلين جلايكول.

أضف مجسات شد دبوس الشعر الحمض النووي التي تحتوي على دبوس شعر للحمض النووي مهجن مع اثنين من قليل النوكليوتيدات في أذرع متقابلة.

يشتمل خيط الترابط على فلوروفور وبيوتين ، بينما يحتوي حبلا المرساة على مروي ومجموعة ثيول. في هذا الإعداد ، يمنع المروي الفلورة.

ترتبط مجسات الحمض النووي بجسيمات الذهب النانوية ، وتثبت في الغطاء الزجاجي.

إدخال الستربتافيدين ، الذي يتفاعل مع جزيئات البيوتين في خيوط الترابط.

أضف روابط البيوتينيل التي ترتبط بجزيئات الستربتافيدين المرتبطة مسبقا.

تراكب الغطاء بالخلايا التائية الإيجابية CD8 ؛ تتفاعل مستقبلاتها مع الروابط المجمدة ، وتشكل موقعا للتفاعل بين المستقبلات والترابط.

يولد هذا التفاعل قوة تتكشف عن بنية دبوس شعر الحمض النووي ، وتفصل الفلوروفور عن المروي وتعزز انبعاث التألق.

أدخل خيوط قفل غير فلورية تتفاعل مع الأجزاء غير المطوية من المجسات للحفاظ على إشارة التألق.

تحديد كمية التألق لتقييم قوى المستقبلات التي تطبقها الخلايا المناعية.

للبدء ، ضع أغطية مقاس 25 ملم على رف بولي تترافلورو إيثيلين في دورق سعة 50 مليلتر ، واشطف الغطاء ثلاث مرات عن طريق غمرها في الماء. امزج كميات متساوية من الإيثانول والماء ، وأضف 40 مل من هذا المحلول إلى الدورق الذي يحتوي على الرف والأغطية. ثم أغلق الدورق باستخدام شريط بارافيلم.

قم بتنظيف الغطاء عن طريق صوتنة الدورق لمدة 15 دقيقة في منظف بالموجات فوق الصوتية ، وتخلص من السائل بعد الصوتنة. بعد ذلك ، اشطف الدورق الذي يحتوي على الرف والأغطية بالماء ، ست مرات على الأقل لإزالة أي مذيب عضوي متبقي. لتحضير محلول سمكة البيرانا الطازجة ، أضف 30 مل من حمض الكبريتيك إلى دورق سعة 50 مليلتر وأضف ببطء 10 مل من بيروكسيد الهيدروجين. امزج محلول سمكة الضاري المفترسة برفق باستخدام طرف ماصة زجاجية.

لبدء النقش ، انقل الرف الذي يحمل الغطاء إلى الدورق الذي يحتوي على محلول سمكة المفترس ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتنظيف الغطاء وهيدروكسيله. بعد ذلك ، انقل الرف باستخدام ملاقط فولاذية أو بولي تترافلورو إيثيلين إلى دورق نظيف سعة 50 مليلتر واشطفه بالماء ست مرات. من أجل إزالة الماء تماما ، اغمر الرف الذي يحمل الغطاء في دورق سعة 50 مليلتر مع 40 مل من الإيثانول ، ثم تخلص من الإيثانول.

بعد ذلك ، اغمر الرف في 40 مل من الإيثانول الذي يحتوي على 3٪ أمينوبروبيل ثلاثي إيثوكسي سيلان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لبدء التفاعل مع مجموعة الهيدروكسيل على الغطاء. اشطف سطح الغطاء ست مرات عن طريق غمرها في 40 مل من الإيثانول ، وجففها في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

قم بتغطية الجزء السفلي الداخلي من طبق بتري بشريط بارافيلم لمنع الغطاء من الانزلاق داخل طبق بتري. بعد ذلك ، ضع الطبقات المغطاة بالأمين بحيث يكون الجانب المراد تشغيله مع مواجهة مجسات شد الحمض النووي لأعلى. قم بتغطية الغطاء عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامه في المستقبل.

لتعديل مجموعات الأمين على الغطاء, إضافة حمض ليبويك-PEG-NHS و mPEG-NHS واحتضان طبق بتري في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. في نهاية الحضانة ، اشطف السطح ثلاث مرات بالماء. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 0.1 مولار تحتوي على 1 ملليغرام لكل مليلتر من سلفو-NHS-acetate إلى مجموعة من أغطية الساندويتش ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة حتى يحدث التخميل.

أضف 0.5 مل من جزيئات الذهب النانوية إلى كل غطاء واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اشطف الأغطية بالماء ثلاث مرات. بعد إضافة حبلا مروي الثقب الأسود 2 إلى مسبار توتر الحمض النووي الملدن بنسبة 10 إلى 1 ، أضف 100 ميكرولتر من الخليط لكل غطاءين لعمل الشطيرة.

ضع كرة مناديل مختبر مبللة بحذر في طبق بتري بعيدا عن الغطاء ، وأغلق الطبق بشريط بارافيلم لمنع المحلول من الجفاف. بعد ذلك ، غطي الطبق بورق ، واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتجميع غرفة التصوير مع الحرص على منع تشقق السطح أثناء شد الغرفة. ثم أضف 0.5 إلى 1 مل من محلول الملح المتوازن من هانك إلى غرفة التصوير.

استخدم قناة Cy3B بهدف 100x لالتقاط إشارات الفلورسنت للخلايا المطلية على مجسات توتر دبوس الشعر في الحمض النووي عندما تبدأ في الانتشار. بعد تحضير 100 مخزون من خيوط قفل الميكرومولار غير الفلورية ، في النقطة الزمنية المطلوبة ، قم بإضافتها إلى الخلايا بتركيز نهائي قدره 1 ميكرومولار في غرفة التصوير لتخزين إشارة التوتر ، وخلطها مع الخلايا عن طريق سحب العينات.

بعد حوالي 10 دقائق من القفل ، احصل على أفلام بفاصل زمني أو صور نقطة النهاية في التألق لكل من رسم خرائط التوتر النوعي والتحليل الكمي.