استخدام الطبقات الدهنية الثنائية المدعومة بالخرز للتحقيق في الإخراج المشبكي من الخلايا التائية

خذ طبقات ثنائية الدهون المدعومة بالخرز ، أو BSLBs ، وهي حبات سيليكا مطلية بطبقات ثنائية دهنية مترافقة بمجمعات الببتيد - معقد التوافق النسيجي الكبير المستضدية ، والالتصاق وجزيئات التحفيز المشترك ، والتي تعمل كخلايا تقدم مستضد اصطناعي.

احتضان بالخلايا التائية.

ترتبط TCRs بالببتيدات المستضدية الموجودة على BSLBs ، والتي ، جنبا إلى جنب مع الإشارات التحفيزية المشتركة ، تشكل مشبك مناعي ، مما ينشط الخلايا التائية.

هذا الارتباط إلى شلالات إشارات داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى إعادة ترتيب الأكتين وتشكيل مجموعات دقيقة في المشبك الذي يحتوي على جزيئات الالتصاق والإشارات.

تطلق الخلايا التائية حويصلات عبر التشابك المخصبة في TCRs ، والجزيئات المحفزة المشتركة ، ومحتويات الحبيبات اللايتية في المشبك ، وترتبط ب BSLBs.

قم بتبريد الزراعة المشتركة تدريجيا لفصل BSLBs عن الخلايا التائية.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية. استخدم عازلة تحتوي على البروتين لسد مواقع الارتباط الحرة على الأسطح.

أجهزة الطرد المركزي وعلاج الخلايا BSLBs و T بالأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور التي ترتبط بجزيئات إشارات محددة وتحفيزات مشتركة.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، قم بتحليل إشارات التألق من الخلايا BSLBs والخلايا التائية لتحديد كمية الناتج المتشابك.

أعد تعليق 500,000 BSLBs لكل بئر في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS / HSA. انقل 100 ميكرولتر من BSLBs لكل بئر إلى صفيحة جديدة ذات 96 بئرا على شكل حرف U لعمل نسخة مكررة ، بحيث تكون الكمية النهائية من BSLB لكل بئر 250,000. قم بتدوير BSLBs عند 300 مرة جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق BSLBs باستخدام 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا التائية. تخلط بلطف لمنع تكون الفقاعات. احتضن المزارع المشتركة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

قم بحماية الخلايا من الضوء ، وتبريد الثقافات المشتركة عن طريق احتضانها أولا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل. الطرد المركزي للمزارع المشتركة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 500 مرة جم ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق المزارع المشتركة في الكالسيوم والمغنيسيوم الخالي من الأيونات 2٪ BSA-PBS في درجة حرارة الغرفة للحظر. ضع الخلايا على الجليد لمدة 45 دقيقة ، واحميها من الضوء.

قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة الرئيسي باستخدام BSA و PBS 2٪ المفلتر باللون المثلج المثلج 0.22 ميكرومتر كمخزن مؤقت للتلطيخ. سيوفر هذا المزيج الرئيسي حجب إضافيا. قم بتدوير الثقافات المشتركة عند 500 مرة جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية. تخلص من المواد الطافية ، ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لإعادة تعليق الخلايا في المزيج الرئيسي القائم الذي يحتوي على تركيزات محسنة للأجسام المضادة.

قم بتضمين الخلايا المسماة بالنمط المتماثل و BSLBs ، و BSLBs الفلورية وغير الفلورية ، والخلايا و BSLBs الملطخة بمفردها. امزج برفق عن طريق سحب نصف الحجم لأعلى ولأسفل. احتضن لمدة 30 دقيقة على الثلج واحميها من الضوء. اغسل الخلايا و BSLBs مرتين باستخدام مثلج بارد 2٪ BSA-PBS قم بتدويرها عند 500 مرة جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، تحقق من المزارع المشتركة المترسبة في قاع الآبار. بعد ذلك ، قم بتعليق الثقافات المشتركة المغسولة في 100 ميكرولتر من PBS واحصل عليها على الفور.