موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 5:52 دقيقة • July 8th, 2025
خذ صفيحة متعددة الآبار مغلفة بالجيلاتين تحتوي على خلايا سرطان الدماغ البشرية الملتصقة التي تعبر عن CXCR4.
استبدل الوسائط بصبغة حساسة للكالسيوم. تشق الإسترازات داخل الخلايا الصبغة إلى منتج غير منفذ للغشاء يرتبط بأيونات الكالسيوم ، مما يؤدي إلى زيادة الفلورة.
قم بإزالة الصبغة واغسلها وإضافة المخزن المؤقت.
ضع اللوحة في قارئ صفيحة دقيقة مضان مع مركب متفاعل CXCR4 وألواح تحتوي على الكيموكين CXCL12.
باستخدام معلمات آلية محددة ، قم بحقن تركيزات مركبة متزايدة في آبار الاختبار ، متبوعا بتركيز CXCL12 محدد.
في آبار التحكم بدون المركب ، يرتبط CXCL12 ب CXCR4.
ينشط هذا الارتباط سلسلة إشارات ، ويطلق أيونات الكالسيوم في السيتوبلازم ، حيث تربط الصبغة ، مما يؤدي إلى تكثيف التألق.
ومع ذلك ، في آبار الاختبار ، تمنع المركبات المتفاعلة ارتباط CXCL12 ب CXCR4 ، مما يؤثر على تعبئة الكالسيوم ويسبب انخفاضا في التألق المعتمد على الجرعة ، مما يؤكد أنها مضادات CXCR4.
في يوم مرور الخلية ، قم بتغطية كل بئر من صفيحة البوليسترين ذات الجدران السوداء المكونة من 96 بئر بقيعان شفافة مع 100 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.1٪ ، واحتضان الألواح لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. أثناء تصلب الجيلاتين ، استخدم محلول التربسين-EDTA لرفع الخلايا ذات الأهمية من قاع قارورة الثقافة الخاصة بها ، وإعادة تعليق الخلايا في وسط نمو جديد في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر بمجرد انفصالها.
بعد العد ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط نمو جديد إلى 1 × 105 خلايا قابلة للحياة لكل تركيز مليلتر. عندما تصبح الألواح جاهزة ، تخلص من أي محلول جيلاتين زائد ، وجفف الألواح على منديل المختبر. بعد ذلك ، اغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من PBS ، واستبدل الغسيل ب 200 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر ، لحضانة ليلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في صباح اليوم التالي ، اضغط على اللوحة للتخلص من وسط النمو من الآبار ، وجفف اللوحة رأسا على عقب على منشفة ورقية. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا في كل بئر ب 100 ميكرولتر من محلول صبغة التحميل لكل بئر ، واحتضان اللوحة لمدة 45 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. أثناء احتضان الخلايا ، أضف 75 ميكرولترا من CXCL12 لكل بئر إلى صفيحة الكيموكين ، و 50 ميكرولترا من المركب الذي يهم كل بئر من اللوحة المركبة.
بعد ذلك ، قم بتشغيل وحدة التبريد لقارئ اللوحة الفلورية ، متبوعة بقارئ اللوحة نفسه. بعد السماح للنظام ببضع دقائق للبدء ، افتح برنامج قارئ الألواح. لإعداد بروتوكول المقايسة ، ضمن علامة التبويب الإعدادات ، حدد وضع القراءة ، والطول الموجي المناسب للإثارة والانبعاث لصبغة التحميل.
حدد علامة التبويب "المزج مع سائل النقل" للخلط التلقائي للمركبات في اللوحة المركبة. في علامة التبويب "نقل السوائل"، اضبط 20 ميكرولترا من كل بئر من اللوحة المركبة ليتم نقلها إلى لوحة القياس، ثم ضع أطراف الماصة على ارتفاع 20 ميكرولترا تحت سطح السائل. اضبط سرعة الشفط على 50 ميكرولتر في الثانية ، وسرعة الاستغناء عن 25 ميكرولتر في الثانية وانقر فوق "القراءة باستخدام سائل النقل".
خلال الفترة الأولى ، حدد 60 قراءة مع فاصل قراءة يبلغ ثانية واحدة مع تسجيل 10 قراءات قبل توزيع المركبات في لوحة القياس ، و 50 قراءة تكتمل بعد ذلك. اضبط الفاصل الزمني الثاني مع وقت الفاصل الزمني للقراءة البالغ 30 ثانية و 18 قراءة. حدد ثلاث غسلات طرفية للبروتوكول ، واضبط كل خطوة غسيل لتشمل سائل الغسيل المناسب ، ودورة غسيل واحدة ، وسرعة مضخة سريعة ، وخمس ضربات لكل غسلة.
استخدم وظيفة "إيقاف الماصة مؤقتا" لتضمين إيقاف مؤقت لسحب الماصة لمدة 300 ثانية واستخدم إعداد "المزج مع سائل النقل" للسماح بالخلط التلقائي لمحلول CXCL12 داخل لوحة الكيموكين. في علامة التبويب "نقل السوائل" اللاحقة ، اضبط 25 ميكرولترا من كل بئر من لوحة الكيموكين ليتم نقلها إلى لوحة القياس وضع الأطراف 20 ميكرولترا تحت سطح السائل. اضبط سرعة الشفط على 50 ميكرولتر في الثانية ، وسرعة الاستغناء عن 25 ميكرولتر في الثانية.
استخدم الزر "القراءة باستخدام سائل النقل" لتعيين الفاصل الزمني الأول ليشمل 145 قراءة مع فاصل زمني للقراءة يبلغ ثانية واحدة. اضبط الفاصل الزمني الثاني على وقت فاصل قراءة مدته ست ثوان و20 قراءة. حدد ثلاث دورات أخرى لطرف الغسيل ، ثم انقر فوق "ضبط درجة حرارة المرحلة" واضبط درجة حرارة الجهاز على 37 درجة مئوية.
في نهاية حضانة صبغة التحميل ، تخلص من المخزن المؤقت من لوحة القياس وجفف اللوحة على مناديل المختبر. اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر لكل بئر من المخزن المؤقت للفحص ، واستبدل المخزن المؤقت ب 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص بعد دقيقتين. ضع لوحة القياس في موضع القراءة ، واللوحة المركبة في موضع المصدر 2 ، ولوحة الكيموكين في موضع المصدر 3 ، وصندوق من الأطراف السوداء في موضع المصدر 1.
أغلق الجهاز وانقر فوق "اختبار إشارة البروتوكول" لتحديد وحدات الضوء النسبي للخلفية ومتغيرات التألق فوق اللوحة. حدد اختبار "الإشارة" في النافذة المنبثقة. إذا تم الحصول على قيم خلفية من 8,000 إلى 10,000 وحدة إضاءة نسبية ، فحدد "تحديث" وانقر فوق "حفظ" لحفظ البروتوكول الرئيسي.