القياس في المختبر لنشاط إنزيم α-Galactosidase A وحمض α-جلوكوزيداز

α-galactosidase A وحمض α-جلوكوزيداز إنزيمات ليزوزومية ضرورية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي.

يقوم α-galactosidase A بتكسير ركائز مثل الجليكوليبيدات ، بينما يقوم حمض α-جلوكوزيداز بتحلل الجليكوجين.

لقياس نشاط الإنزيم في المختبر ، خذ آبارا متعددة الآبار مع عينات تحتوي على تركيزات معروفة من α-galactosidase A وحمض α-glucosidase ، على التوالي.

أضف الحجم المطلوب من المحاليل الحمضية من ركائز 4-Methylumbelliferyl الاصطناعية إلى الآبار ، وهي ركائز فلورية محددة مصممة لتقليد الركائز الطبيعية لهذه الإنزيمات.

احتضن في الظلام.

تشق إنزيمات α-galactosidase A وإنزيمات α-glucosidase الحمضية ركائزها الخاصة ، وتطلق منتج الفلورسنت ، 4-methylumbelliferone.

أضف عازلة قلوية لإنهاء التفاعل الأنزيمي.

باستخدام قارئ مضان صفيحة دقيقة ، قم بقياس شدة التألق ل 4-methylumbelliferone في الآبار ، مما يدل على تركيزه ، لتحديد نشاط إنزيم α-galactosidase A وحمض α-glucosidase ، على التوالي.

قم

بتخفيف الكمية المحسوبة لكل عينة وماصتها في أنابيب تفاعل جديدة سعة 1.5 ملليلتر للحصول على 0.05 ميكروغرام من ألفا جالاكتوزيداز أ أو 0.5 ميكروغرام من حمض ألفا جلوكوزيداز لكل ميكرولتر من المحلول. قم بتدوير العينات لمدة 5 ثوان مرة أخرى ، وقم بتقطيع 10 ميكرولترات من هذا التخفيف وتكرارها في صفيحة سعة 96 بئرا.

ابدأ التفاعلات بإضافة 20 ميكرولتر من محلول الركيزة المعني. بالنسبة إلى alpha-galactosidase A ، أضف 2 مللي مولار 4-methylumbelliferyl-alpha-D-galactopyranoside أو 4-MU-Gal في محلول سترات فوسفات 0.06 مولار ، الرقم الهيدروجيني 4.7. بالنسبة لحمض ألفا جلوكوزيداز ، أضف 2 مللي مولار 4-methylumbelliferyl-alpha-D-glucopyranoside أو 4-MU-Glu في 0.025 أسيتات الصوديوم المولار ، درجة الحموضة 4.0.

احتضان تفاعلات الإنزيم لمدة ساعة واحدة في الظلام عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة على شاكر مداري. بعد ذلك، قم بإنهاء التفاعل بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهيدروكسيد الصوديوم الجلايسين 1.0 مولي 10.5. قم بإعداد منحنى قياسي قدره 4-MU من مخزون 0.01 ملليغرام لكل مليلتر وفقا لبروتوكول النص ، وقم بتقطيع 10 ميكرولترات من المحاليل في نسختين في صفيحة سعة 96 بئرا.

أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهيدروكسيد الصوديوم 1.0 مولار جلايسين إلى كل بئر لضبط الحجم ودرجة الحموضة. أخيرا ، قم بقياس نشاط الإنزيم في قارئ مضان مزود بمجموعة المرشحات المناسبة ، وقم بتحليل البيانات باستخدام البرنامج المناسب لجهاز قارئ الفلورة.