مقايسة لتقييم تأثير مركبات الاختبار على دخول الفيروس والاندماج في الخلايا المضيفة

خذ خلايا سرطان الكبد ، واحتضن في درجة حرارة منخفضة لإضعاف الالتقام الخلوي.

إدخال فيروس التهاب الكبد C المؤتلف أو HCV ، والذي يتألف من جينوم RNA مصمم هندسيا يشفر مراسل لوسيفيراز مفرز.

تتفاعل البروتينات الدهنية الفيروسية مع البروتيوغليكان على الخلايا المضيفة ، بينما ترتبط البروتينات السكرية في الغلاف الفيروسي بمستقبلات مضيفة معينة.

في الآبار المختارة ، أضف مركب الاختبار الذي يرتبط بالبروتينات السكرية الفيروسية.

عند الحضانة في درجة حرارة فسيولوجية ، يتم تكسير الفيروسات المرتبطة.

تخلص من الفيروسات غير الداخلية ، وأضف وسائط نمو ، واحتضنها.

في الآبار غير المعالجة ، تساعد البروتينات السكرية في اندماج الجسيم الداخلي للغلاف الفيروسي ، مما يؤدي إلى إطلاق النوكليوكابسيد ، بينما يضعف الإخفاء المركب الاندماج في الآبار المعالجة.

عند إطلاقه ، يعبر الحمض النووي الريبي عن البروتينات الفيروسية ، بما في ذلك لوسيفيراز الذي يفرز خارج الخلية.

احصد المادة الطافية المحتوية على اللوسيفيراز وأضف ركيزة مضيئة بيولوجيا ، والتي تتأكسد بواسطة لوسيفيراز لإصدار الضوء.

يشير انخفاض التلألؤ في الآبار المعالجة مقارنة بالآبار غير المعالجة إلى تثبيط اندماج الغلاف الفيروسي.

لفحص الاندماج الفيروسي ودخوله ، قم بتبريد لوحة زراعة الخلية مسبقا عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة بعد الحضانة الليلية لربط الخلية. قم بإزالة الوسط الموجود من الآبار ، وقم بإصابة الخلايا ب 10 إلى ثاني FFU HCV على الجليد.

احتضان الطبق على حرارة 4 درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS المثلج لإزالة الفيروس غير الملتصق. بعد ذلك ، على الجليد ، عالج الخلايا بمركب اختبار مذاب في وسط قاعدي أو متوسط قاعدي مع 1٪ DMSO كعنصر تحكم ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. يسمح هذا بتقييم مركبات الاختبار عند دخول الفيروس ، والذي يحدث عند 37 درجة مئوية.

استنشق الوسط واغسل الفيروسات غير الداخلية مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من عازلة السترات أو PBS. أضف 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي لكل بئر ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة أخرى. اجمع المادة الطافية وقم بإجراء اختبار Gaussia luciferase كما هو موضح من قبل للكشف عن مراسل luciferase الذي تم إصداره.