اختبار مراسل لوسيفيراز لدراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة بفيروس الجدري

خذ مجمعات التعداء التي تشتمل على mRNAs للمراسل التي تشفر لطيور اليراع ، أو Fluc ، و Renilla luciferase ، أو Rluc.

يحتوي Fluc mRNA على تسلسل بولي أدينوزين 5 بوصات ، أو زعيم بولي (A) ، بينما يفتقر Rluc mRNA إلى هذا التسلسل.

نقل

خلايا الثدييات غير المصابة والمصابة بفيروس الجدري لتوصيل mRNAs للمراسل ، واحتضانها.

في الخلايا غير المصابة ، ترتبط عوامل البدء حقيقية النواة بغطاء mRNA 5 '، متبوعا بتجنيد الوحدة الفرعية الريبوسومية الصغيرة والحمض النووي الريبي المرسال البادئ.

عند الوحدة الفرعية الصغيرة التي تحدد موقع كودون البداية ، تنضم الوحدة الفرعية الكبيرة لتصنيع بروتينات لوسيفيراز.

في الخلايا المصابة ، تتسبب الفسفرة بوساطة فيروس الجدري للوحدة الفرعية الصغيرة في تجميع الريبوسوم مباشرة على تسلسل الزعيم ، مما يعزز إنتاج Fluc.

قم بتحليل الخلايا لإطلاق اللوسيفيرازات.

أضف ركيزة Fluc ، التي يؤكسدها الإنزيم ، وينبعث منها الضوء. باستخدام قارئ لوحة ، قم بقياس اللمعان.

كرر الخطوة ل Rluc لتحديد الزيادة النسبية في تلألؤ Fluc مقارنة ب Rluc في الخلايا المصابة بالفيروس.

قم بزراعة خلايا HeLa في صفيحة مكونة من 24 بئرا لتحقيق التقاء بنسبة 80٪ إلى 90٪ في اليوم التالي ، وتحتضن بين عشية وضحاها في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. إصابة خلايا HeLa بفيروس Vaccinia في تعدد العدوى من 5 والاحتفاظ بخ