اختبار لدراسة تأثير تصلب المصفوفة خارج الخلية على العدوى البكتيرية

خذ الآبار التي تحتوي على هيدروجيل بولي أكريلاميد ذو صلابة متفاوتة مغطاة بالكولاجين ، تحاكي مصفوفة فسيولوجية خارج الخلية ، أو ECM.

أضف الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة التي تشكل التصاقات بؤرية، أو FAs — المجمعات التي تتوسط ارتباط الخلية بوحدة التحكم في المحرك — لاستشعار تصلب الهيدروجيل.

تعمل

الهلاميات المائية الأكثر صلابة على رفع التعبير عن سطح الخلية للفيمنتين ، وهو مكون هيكل خلوي ، مقارنة بالهلاميات المائية الأكثر ليونة.

أضف بكتيريا الليستيريا monocytogenes ، المصممة للتعبير عن بروتين الفلورسنت تحت المحفز للبروتين المحفز لتجميع الأكتين ، أو ActA.

جهاز الطرد المركزي لمزامنة التلامس البكتيري مع الخلايا المضيفة ، واحتضانه.

ترتبط البكتيريا بالفيمنتين. يؤدي المزيد من الفيمنتين على الخلايا المضيفة الأكثر صلابة المرتبطة بالهيدروجيل إلى مزيد من الالتصاق البكتيري والالتقام الخلوي.

أضف مضادا حيويا للقضاء على البكتيريا غير الداخلية.

تفرز البكتيريا الداخلية السموم ، مما يؤدي إلى تمزق الغشاء الداخلي. ينشط الهروب السيتوبلازمي محفز ActA للتعبير عن البروتين الفلوري ، ووضع علامات على البكتيريا داخل الخلايا.

افصل الخلايا إنزيميا. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، اكتشف تألق أعلى في الخلايا المضيفة الموجودة على الهلاميات المائية الأكثر صلابة ، مما يشير إلى استيعاب بكتيري أكبر.

بعد تحضير ثقافة ليلية من L. monocytogenes وفقا لبروتوكول النص ، انقل 1 مليلتر من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، وقم بتدويرها عند 2,000 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق. بعد استخدام PBS من فئة زراعة الأنسجة لغسل الحبيبات مرتين, استخدم 1 ملليلتر من PBS لإعادة تعليق الحبيبات.

قم بإعداد مزيج العدوى عن طريق الجمع بين 10 أو 50 ميكرولتر من المعلق البكتيري مع 1 مليلتر من MCDB-131 الوسط الكامل لتعدد العدوى ، أو وزارة الداخلية ، من حوالي 50 بكتيريا لكل خلية مضيفة أو 10 بكتيريا لكل خلية مضيفة. قم بإزالة الوسط من آبار الألواح المكونة من 24 بئرا ، مع الحرص على عدم تعطيل الهلاميات المائية أو الخلايا. استخدم 1 مليلتر من MCDB-131 كامل الوسط لغسل الخلايا مرة واحدة ، ثم أضف 1 مليلتر من البكتيريا إلى كل بئر.

ضع الغطاء على الأطباق ولفها بغلاف طعام من البولي إيثيلين لتجنب التسرب. الطرد المركزي الألواح عند 2,000 مرة ز لمدة 10 دقائق لمزامنة الغزو. ثم احتضن الثقافات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. باستخدام MCDB-131 كامل الوسط ، اغسل العينات 4 مرات وأعدها إلى حاضنة زراعة الأنسجة. بعد 30 دقيقة إضافية ، استبدل الوسط بمتوسط كامل MCDB-131 مكمل ب 20 ميكروغراما لكل مليلتر من الجنتامين.

لإجراء قياس التدفق الخلوي بعد ثماني ساعات من الإصابة ، قم بإزالة الوسط من آبار اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واستخدم زراعة الأنسجة PBS لغسل الآبار مرة واحدة. بعد إزالة PBS ، أضف 200 ميكرولتر من مزيج التربسين - EDTA - الكولاجيناز إلى كل بئر. ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 10 دقائق للسماح بالانفصال الكامل للخلايا.

بعد سحب كل بئر برفق ثماني مرات ، أضف 200 ميكرولتر من الوسط الكامل لتحييد التربسين. انقل 400 ميكرولتر من محلول الخلية من كل بئر إلى أنبوب بوليسترين سعة 5 ملليلتر بغطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر. تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي.