$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
خذ صفيحة متعددة الآبار مع طبقات أحادية للخلايا البطانية البشرية الملتصقة على هيدروجيل بولي أكريلاميد مطلي بالكولاجين ذو صلابة متفاوتة.
تخضع
الخلايا الموجودة على الهلاميات المائية الأكثر صلابة لإعادة تنظيم الهيكل الخلوي بشكل كبير ، مما يزيد من التوتر داخل الخلايا ، مقارنة بالهلاميات المائية الأكثر ليونة.
اغسل الخلايا بالوسائط وأضف Listeria monocytogenes المهندسة - التي تعبر عن بروتين فلوري تحت محفز البروتين المحفز لتجميع الأكتين (ActA).
أجهزة الطرد المركزي لتسهيل الاتصال بين الخلايا والبكتيريا. احتضان للتوسط في الالتقام الخلوي البكتيري.
يغسل بالوسائط. يعالج بالجنتاميسين للقضاء على البكتيريا غير الداخلية. حضن.
تطلق البكتيريا الداخلية السموم المكونة للمسام ، مما يؤدي إلى تعطيل الأغشية البلعمة. تعمل البكتيريا العصارية الخلوية على تنظيم ActA وتعبير البروتين الفلوري ، وتصنيف البكتيريا داخل الخلايا.
تحفز بروتينات ActA بلمرة الأكتين ، وتشكل ذيل مذنب الأكتين الذي يدفع البكتيريا إلى الأمام ، مما يتسبب في استيعاب الخلايا المجاورة ، وتعزيز الانتشار.
بعد الحضانة ، استخدم الوسائط المحتوية على الصبغة لتلطيخ نوى الخلايا. استبدل الوسائط بوسائط تحتوي على الجنتاميسين.
إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني.
تعمل الهلاميات المائية اللينة على تعزيز الانتشار السريع للبكتيريا بين الخلايا مقارنة بالهيدروجيلات الأكثر صلابة مع زيادة التوتر داخل الخلايا ، مما يشير إلى انتشار البكتيريا المعتمد على صلابة المصفوفة.
بعد تحضير ثقافة ليلية من L. monocytogenes وفقا لبروتوكول النص ، انقل 1 مليلتر من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، وقم بتدويرها عند 2,000 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق. بعد استخدام PBS من فئة زراعة الأنسجة لغسل الحبيبات مرتين, استخدم 1 ملليلتر من PBS لإعادة تعليق الحبيبات.
قم بإعداد مزيج العدوى عن طريق الجمع بين 10 أو 50 ميكرولتر من المعلق البكتيري مع 1 مليلتر من MCDB-131 الوسط الكامل لتعدد العدوى ، أو وزارة الداخلية ، من حوالي 50 بكتيريا لكل خلية مضيفة أو 10 بكتيريا لكل خلية مضيفة. قم بإزالة الوسط من آبار الألواح المكونة من 24 بئرا ، مع الحرص على عدم تعطيل الهلاميات المائية أو الخلايا.
استخدم 1 مليلتر من MCDB-131 كامل الوسط لغسل الخلايا مرة واحدة ، ثم أضف 1 مليلتر من البكتيريا إلى كل بئر. ضع الغطاء على الأطباق ولفها بغلاف طعام من البولي إيثيلين لتجنب التسرب. الطرد المركزي للألواح عند 2,000 × جم لمدة 10 دقائق لمزامنة الغزو. ثم احتضن الثقافات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. باستخدام MCDB-131 كامل الوسط ، اغسل العينات 4 مرات وأعدها إلى حاضنة زراعة الأنسجة. بعد 30 دقيقة إضافية ، استبدل الوسط بمتوسط كامل MCDB-131 مكمل ب 20 ميكروغراما لكل مليلتر من الجنتامين.
بعد زرع خلايا HMEC-1 على الهلاميات المائية PA ومعالجتها بالجنتاميسين وفقا لبروتوكول النص ، احتضن اللوحة لمدة خمس ساعات للسماح لموروج ActA بتشغيل وتشغيل تعبير إطار القراءة المفتوح mTagRFP.
بعد أربع ساعات من الإصابة ، امزج 1 ميكرولتر من صبغة Hoechst 1 مجم / مل مع 1 مليلتر من L15 كامل الوسط وأضفه إلى كل بئر لتلطيخ النوى. بعد احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق ، استبدل الوسط ب 1 مليلتر من L15 كامل متوسط مكمل ب 20 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين.
قم بتصوير مواضع متعددة كل 5 دقائق باستخدام ميزة التركيز البؤري التلقائي لمراقبة كيفية انتشار البكتيريا المحورة وراثيا عبر طبقات أحادية HMEC-1 المصنفة على الهلاميات المائية المختلفة الصلابة.