تحديد الفعالية المضادة للفيروسات للأدوية التجريبية من خلال فحص البلاك

ابدأ بعينة تحتوي على فيروس تم الحصول عليها من قرنية خنزير مصابة معالجة بدواء مضاد للفيروسات.

قم بإجراء تخفيف تسلسلي للعينة لإنشاء سلسلة من تناقص تركيزات الفيروس.

التخفيف الأمثل يمنع عدوى خلية واحدة بفيروسات متعددة.

أدخل العينات المخففة إلى طبقة أحادية الخلية المضيفة واحتضنها.

يرتبط الفيروس بمستقبل الخلية المضيفة ، ويدخل الخلية ، ويبدأ في تكاثره. تتحلل الخلية المصابة ، وتطلق الفيروسات.

أضف ميثيل السليلوز ، وهي مادة لزجة تحصر الفيروسات في الخلايا القريبة.

بعد ذلك ، تسبب الفيروسات موت الخلايا وتكوين البلاك في المنطقة المصابة.

أضف الميثانول لإصلاح الخلايا.

استخدم البنفسج الكريستالي لتلطيخ الخلايا الحية.

لاحظ اللويحات كمناطق واضحة تشير إلى الخلايا المصابة وموت الخلايا ، وتحيط بها خلايا غير مصابة ملطخة بالبنفسج الكريستالي.

أخيرا ، احسب عدد اللويحات بأعلى تخفيف لتحديد عيار الفيروس في محلول البداية لتحديد فعالية الدواء المضاد للفيروسات.

لتحديد كمية الفيروس التي تم جمعها من كل قرنية ، قم بإعداد سجل₁₀ تخفيف للفيروس في وسط خال من المصل في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة حتى يتم الوصول إلى تخفيف 1 × ^10-8.

بعد شفط وسط النمو من كل بئر من الخلايا ، انقل 1 مليلتر من كل تخفيف للفيروس ، بدءا من 1 × ^10-3 إلى طبقات أحادية الخلية المطلية ، وضع الخلايا المصابة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، اغسل كل بئر برفق مرتين باستخدام PBS قبل إضافة 2 مل من وسط محمل بميثيل السليلوز إلى كل بئر لمدة 72 ساعة ، أو حتى يمكن ملاحظة تكوين اللويحات.

عند ملاحظة البلاك ، أضف ببطء 1 مليلتر من الميثانول إلى زاوية كل بئر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، استنشق المحتويات ببطء من كل بئر دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية.

بعد ذلك ، قم بتسمية كل بئر ب 1 ملليلتر من محلول العمل البنفسجي الكريستالي ، مع الحرص على تغطية جميع الخلايا لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، تخلص من المحلول وجفف الآبار على ورقة ماصة. بعد ذلك ، احسب عدد اللويحات في أعلى بئر تخفيف لتحديد إجمالي محتوى الفيروس في محلول البداية 3 مرات.