اختبار لتحديد بدء الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات على الخلايا المصابة بالفيروس

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على طبقات أحادية من خلايا الثدييات.

اختبار

البذور مع فيروس الهربس البسيط. تفتقر آبار التحكم إلى الفيروس.

يرتبط الفيروس بكبريتات الهيباران على سطح الخلية ويتم استيعابه عن طريق الالتقام الخلوي.

تؤدي

العدوى الفيروسية إلى إفراز الهيباراناز ، الذي يشق كبريتات الهيباران ويكشف عن مستقبلات فطرية معينة.

احتضان الخلايا بالمكورات العنقودية الذهبية والأنابيب الجرثومية المبيضات البيضاء.

في الخلايا المصابة بالفيروسات ، يمنع استنفاد كبريتات الهيباران التفاعل البكتيري مع تعزيز تفاعلات المستقبلات الفطرية ، مما يمنع التوطين المشترك للبكتيريا والفطريات.

في الخلايا الضابطة ، تتفاعل البكتيريا مع كبريتات الهيباران ، بينما ترتبط الفطريات بالمستقبلات المتاحة.

يبدأ هذا التوطين الميكروبي المشترك في الالتزام - الخطوة الأولى في تكوين الأغشية الحيوية.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الميكروبات غير المقيدة. تراكب مع مخزن مؤقت للتحلل ، وإطلاق البكتيريا والفطريات في الوسائط.

انشر محللة الخلية على أطباق تحتوي على وسائط النمو. احتضان لتشكيل المستعمرة.

يشير

الانخفاض في المستعمرات البكتيرية مع زيادة مقابلة في المستعمرات الفطرية إلى تثبيط الناجم عن الفيروس للتوطين المشترك للبكتيريا والفطريات وبدء الأغشية الحيوية.

لإجراء فحص الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات ، قم بزرع ألواح 96 بئرا تحتوي على 200 ميكرولتر من 2 في 10 إلى خلايا HeLa الخامسة لكل مليلتر. هز الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة ، قبل احتضانها في 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. استخدم 1x الأمثل لغسل الطبقات الأحادية. ثم ، البذور مع سلالة واحدة من فيروس الهربس البسيط. اختبر سلالة واحدة فقط في كل مرة.

احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات. باستخدام 100 ميكرولتر من 37 درجة مئوية PBS مع المغنيسيوم والكالسيوم ، اغسل الطبقات الأحادية المصابة. ثم استخدم 37 درجة مئوية HBSS لاستبدال PBS. اترك 25 ميكرولترا من HBSS في كل بئر.

بعد ذلك ، أضف GT و / أو S. aureus معلقات العمل ، واحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، استنشق عمودا واحدا من اللوحة في كل مرة. أعد ملء الآبار على الفور باستخدام 300 ميكرولتر من PBS بالمغنيسيوم والكالسيوم.

بعد تكرار خطوة الغسيل هذه مرتين ، أضف 200 ميكرولتر عند تخفيف 1 إلى 50 من محلول تحلل RIPA المعقم بالفلتر إلى كل بئر.

عند العمل مع سلالات أخرى من البكتيريا أو الفطريات ، تأكد من أن تركيز RIPA المستخدم كاف لتحلل الخلايا ، ولكنه لا يزال متساهلا لاختبار الجدوى الميكروبية.

قم

بترتيزات خلية HeLa بسرعة ، وقم بتقطيع 50 ميكرولتر على أملاح المانيتول و / أو وسط مبيد للفطريات. ثم ، باستخدام قضيب زجاجي مثني بزاوية 90 درجة ، انشر المحللة على سطح اللوحة.

بعد احتضان الألواح لمدة 18 ساعة ، احسب يدويا عدد المستعمرات لكل طبق. تتكون الضوابط من المكورات العنقودية الذهبية و / أو المطثية البيضاء الالتزام بخلايا HeLa غير المصابة بفيروس الهربس البسيط.