تحقيق التدفق في المختبر لتأثير الخلايا اللحمية على تجنيد الكريات البيض

خذ غرف التدفق المجمعة مسبقا المتصلة بأنظمة التدفق مع مرشحات transwell: واحدة بها زراعة أحادية البطانية في الأعلى والأخرى مع مزرعة بطانية في الأعلى والخلايا اللحمية في الأسفل.

تتم معالجة كلتا الغرفتين مسبقا بالسيتوكين المؤيد للالتهابات.

في الزراعة الأحادية ، تنشط السيتوكينات الخلايا البطانية ، مما يؤدي إلى تنظيم التعبير عن جزيء الالتصاق.

ومع ذلك ، فإن الحديث المتبادل بين الخلايا اللحمية والبطانية في الزراعة المشتركة يؤدي إلى إنتاج الخلايا اللحمية وسطاء تنظيميين يقلل من تنظيم استجابة الخلايا البطانية للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات.

ضع الغرفة على مرحلة مجهر تباين الطور المقلوب.

إدخال تعليق العدلات.

يتم تجنيد العدلات وترتبط بجزيئات الالتصاق البطانية عبر تفاعلات لاصقة عابرة ، مما يسهل تفاعلها مع الكيموكينات المرتبطة بالسطح ، وتدحرج على طول البطانة.

ينشط هذا التفاعل الإنتجرينات الموجودة على العدلات ، مما يؤدي إلى استقرار الالتصاق ويؤدي إلى الانتقال عبر الخلايا البطانية.

ومع ذلك ، في الثقافة المشتركة ، تؤدي الاستجابة البطانية منخفضة التنظيم إلى تجنيد العدلات المكبوتة.

تصور الثقافات تحت الفحص المجهري لتباين الطور لتقييم تجنيد العدلات من التدفق.

بالنسبة لطراز المرشح ، قم أولا بقص قطعة من Parafilm بنفس حجم الغطاء الزجاجي ، باستخدام قالب معدني. بعد ذلك ، قم بقص فتحة 20 × 4 ملم في Parafilm باستخدام قالب معدني لإنشاء قناة التدفق. استخدم حشية Parafilm لتمييز قناة التدفق على زلة الغطاء الزجاجي. قم بمحاذاة حواف المرشح المكون من ستة آبار على زلة الغطاء الزجاجي. تأكد من أن المرشح يغطي علامات قناة التدفق. قم بقص الفلتر بعناية باستخدام مشرط من النوع 10A.

بعد ذلك ، قم بتغطية الفلتر بعناية بحشية Parafilm ، مع التأكد من أن فتحة قناة التدفق في منتصف الفلتر. استخدم قطعة من المناديل النظيفة وادفع أي فقاعات. الآن ، ضع الغطاء في تجويف اللوحة السفلية لغرفة تدفق Perspex.

ضع لوحة Perspex العلوية فوق الجزء العلوي من الحشية ، وقم بربط الألواح معا. أدر الصنبور ثلاثي الاتجاهات للسماح للمخزن المؤقت للغسيل PBS-A بالتدفق عبر الصمام. بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوب مقياس الضغط بمنفذ مدخل لوحة Perspex العلوية. قم بتشغيل PBS-A عبر قناة التدفق للسماح للفقاعات بالمرور.

ثم قم بتوصيل أنبوب مقياس الضغط من مضخة الحقنة بمنفذ مخرج لوحة Perspex. قم بتنظيف أي PBS-A تقطر على اللوحة العلوية للغرفة. أخيرا ، ضع الغرفة على مسرح مجهر تباين الطور المقلوب ، واضبط التركيز لتصور الخلايا البطانية فوق المرشحات.

لنشر الكريات البيض فوق الخلايا البطانية ، اضبط مضخة الحقنة على إعادة التعبئة ، واضغط على تشغيل. بمجرد ضبط التركيز لتصور الطبقة الأحادية للخلية البطانية ، ضع ملليلترين من العدلات المنقاة في خزان العينة ، واتركه دافئا لمدة دقيقتين. ثم اغسل البطانة باستخدام PBS-A لمدة دقيقتين. قم بتشغيل الصمام لنفخ العدلات فوق البطانة. قم بتوصيل بلعة العدلات لمدة أربع دقائق. قم بإيقاف تشغيل الصمام وقم ببث PBS-A من خزان الغسيل للفترة المتبقية من التجربة.

عند إجراء التجربة ، تأكد من عدم مرور فقاعات الهواء في أي وقت أثناء الفحص ، لأن هذا سيعطل الطبقة الأحادية للخلية البطانية ، ويسبب انفصال العدلات الملتصقة.

تسجيل تجنيد العدلات إما أثناء تدفق العدلات أو ما بعد التروية باستخدام برنامج التقاط الصور الرقمية. حدد مركز القناة عن طريق تحريك الهدف إلى حافة القناة عند منفذ المدخل وتحديد منتصف المنفذ. قم بإجراء جميع التسجيلات الرقمية لما لا يقل عن 5 إلى 10 حقول في وسط قناة التدفق.

أثناء التسجيل أثناء تدفق العدلات ، التقط صورا لحقل واحد كل 10 ثوان لمدة دقيقة واحدة. تحرك على طول القناة ، وسجل حقلا آخر لمدة دقيقة واحدة ، وكرر هذه العملية طوال مدة البلعة.

لتسجيل ما بعد التروية ، قم بتسجيل مدته 10 ثوان من 5 إلى 10 حقول أسفل مركز قناة التدفق لتقييم سلوك الكريات البيض. التقط صورا كل ثانية خلال الفاصل الزمني البالغ 10 ثوان. يتيح ذلك وقتا كافيا لتحليل الالتقاط من التدفق وسلوك العدلات الملتصقة.

سجل حقلا واحدا يحتوي على ما لا يقل عن 10 عدلات منقولة لمدة خمس دقائق ، مع التقاط الصور كل 30 ثانية. يمكن استخدام هذا لحساب سرعة الخلايا المهاجرة. سجل سلسلة أخرى من الحقول التي تبلغ مدتها 10 ثوان. هذا يسمح للعدلات بالوقت للهجرة عبر الطبقة الأحادية البطانية.

أخيرا ، أوقف مضخة الحقنة ، وقم بإزالة أنبوب المخرج ثم أنبوب المدخل. قم بتفكيك غرفة التدفق ، واشطف خزان العينة باستخدام PBS-A. كرر مع المرشحات اللاحقة وقنوات الشرائح الدقيقة قبل الشروع في تحليل تجنيد الكريات البيض وسلوكها كما هو موضح في بروتوكول النص.