$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
خذ الخلايا السرطانية المعالجة مسبقا بدواء العلاج الكيميائي الذي يحفز الشيخوخة في نسبة مئوية من الخلايا.
تتراكم هذه الخلايا حبيبات ليبوفوسين ذاتية الفلورسنت ، وهي علامة شيخوخة معروفة.
أضف مضادا حيويا يدخل الخلايا ويمنع مضخات البروتون الليزوزومي ، مما يمنع تحمض الليزوزومي.
تؤدي الزيادة في درجة الحموضة إلى تعطيل الإنزيمات الليزوزومية.
تفرط الخلايا الشائخة في التعبير عن β-galactosidase الليزوزومي حتى عند درجة الحموضة شبه المحايدة ، مما يجعلها مؤشرا حيويا للشيخوخة.
أدخل ركيزة β-galactosidase. حضن.
يقوم
β-galactosidase بتحلل الركيزة الداخلية إلى منتج فلوري ، مع تسمية الخلايا الشائخة.
جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية.
أضف صبغة صلاحية الخلية. داخل الخلايا الحية ، تقوم الإستراز النشط بتحويل الصبغة إلى منتج فلوري غير منفذ للغشاء. تظل الخلايا الميتة ذات سلامة الغشاء المعرضة للخطر غير ملطخة.
باستخدام قياس التدفق الخلوي ، اكتشف الخلايا القابلة للحياة التي تعرض العلامات المزدوجة ليبوفوسين والركيزة الفلورية β-galactosidase ، مما يشير إلى الخلايا الشائخة.
تحديد النسبة المئوية للخلايا السائدة لإثبات فعالية الدواء.
أولا ، اضبط درجة الحموضة الليزوزومية لعينات الخلايا المستزرعة عن طريق إضافة محلول واحد من البابيلومايسين A الميكرومولار في DMEM إلى حبيبات الخلية بتركيز واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر ، والماصة للخلط. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على دوار بسرعة بطيئة. بعد ذلك ، لتلطيخ بيتا جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ، أضف محلول مخزون DDAOG بمعدل 10 ميكروغرام لكل مليلتر إلى العينات دون غسلها.
ضعه على دوار لمدة 60 دقيقة ، محمي من الضوء المباشر. كما كان من قبل ، الطرد المركزي الأنابيب. قم بإزالة المادة الطافية ، واغسل الحبيبات بملليلتر واحد من BSA المثلج 0.5٪ في PBS. ثم أضف 300 ميكرولتر من محلول بنفسجي الكالسين المخفف 450 صباحا إلى كريات الخلية المغسولة. احتضن لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.
نقل عينات الخلية إلى أنابيب متوافقة مع أداة قياس التدفق الخلوي. في برنامج الحصول على البيانات ، افتح الرسم البياني للقناة البنفسجية وقناة حمراء بعيدة مقابل مخطط نقطة القناة الخضراء. ابدأ الحصول على بيانات مقياس الخلوي بسرعة سحب منخفضة وضع عينات التحكم الإيجابية الملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. ابدأ في الحصول على عينة من البيانات. اضبط جهد القناة بحيث يتم احتواء أكثر من 90٪ من الأحداث داخل كل قطعة أرض.
عندما تكون جميع الإعدادات مثالية، سجل 10,000 حدث لكل عينة. ضع عينات التحكم الخاصة بالمركبة فقط الملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. بدء الحصول على البيانات وتسجيل 10,000 حدث لكل عينة. ابحث عن زيادة في التألق الذاتي أو إشارة الضبط البؤري التلقائي و DDAO galactoside مقابل التحكم الإيجابي. احفظ عينة البيانات في . تنسيق ملف FCS وتصدير الملفات إلى كمبيوتر محطة عمل مزود ببرنامج تحليل قياس التدفق الخلوي.