اختبار الالتصاق بالمرحلة الصلبة لتقييم تكوين الأغشية الحيوية

خذ صفيحة مسطحة القاع متعددة الآبار بها آبار تحتوي على بكتيريا في وسط النمو أو بكتيريا في وسط النمو مكملة بالملح الصفروي.

تحفز

الأملاح الصفراوية الإجهاد ، مما يتسبب في تلف الخلايا وإطلاق الحمض النووي والبروتينات. تغطي هذه الجزيئات الحيوية قيعان الآبار ، مما يمكن البكتيريا الباقية من الالتصاق بالسطح الصلب.

تتكاثر البكتيريا المرتبطة ، وتشكل مستعمرات صغيرة وتنتج محفزات ذاتية - أو جزيئات إشارات كيميائية ، مما يسمح بالاتصال البكتيري.

يحفز هذا الاتصال البكتيريا على استعمار وبدء إنتاج المواد البوليمرية خارج الخلية أو EPS ، مما ينتج عنه غشاء حيوي.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط للقضاء على البكتيريا العائمة بحرية.

أدخل صبغة بنفسجية بلورية تتفاعل مع الببتيدوغليكان لجدار الخلية البكتيرية ، مما يمنحها لونا بنفسجيا.

إزالة البقع الزائدة وتجفيف. تراكب بالإيثانول لإذابة البنفسج البلوري من جدار الخلية البكتيرية ، وتغيير لون المحلول.

يؤكد

التلوين الأكثر كثافة في الآبار المعالجة بالملح الصفراوي مقارنة بالآبار غير المعالجة تكوين الأغشية الحيوية من خلال الالتصاق بالطور الصلب.

أولا ، قم بتسمية أنبوبين سعة 1.5 مليلتر باسم TSB و TSB بالإضافة إلى BS. ثم أضف 1 مليلتر من TSB أو TSB بالإضافة إلى BS إلى الأنابيب المعنية.

بعد ذلك ، قم بتلقيح الأنابيب ب 20 ميكرولترا من الثقافة الليلية عند تخفيف 1:50. بعد ذلك ، أضف 130 ميكرولترا من وسائط التحكم غير الملقحة إلى كل من الآبار الثلاثة في صفيحة معقمة وشفافة ومسطحة القاع ومعالجة بزراعة الأنسجة و96 بئرا. سيكون هذا هو عنصر التحكم الفارغ.

أضف 130 ميكرولترا من الثقافة الملقحة في كل من الآبار الثلاثة. بعد إضافة التحكم والثقافة الملقحة في الآبار المعنية ، قم باحتضان الصفيحة المكونة من 96 بئرا لمدة 4 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية بشكل ثابت. بمجرد انتهاء الحضانة ، اضبط عنصر التحكم جيدا على قارئ اللوحة.

بعد ذلك ، استنشق وسط الثقافة من كل بئر. ثم اغسل الآبار برفق مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من PBS المعقمة. بعد الغسيل ، قم بشفط PBS ، ثم اقلب اللوحة حتى تجف لمدة 20 دقيقة تقريبا.

من المهم جدا ضمان إزالة الوسائط برفق والغسيل اللطيف لضمان عدم إزعاج مصفوفة EPS.

بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من البنفسج الكريستالي بنسبة 0.5٪ إلى كل من الآبار التجريبية والسيطرة. ثم احتضن الطبق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق ، اغسل الآبار مرة واحدة ب 400 ميكرولتر من الماء المقطر. أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر لغسل الآبار خمس مرات. بعد كل الغسلات الخمس ، اقلب اللوحة واتركها تجف تماما ، محمية من الضوء.

من أجل الحصول على نتائج متسقة ، من المهم تجفيف العينات جيدا قبل المتابعة.

بعد تجفيف اللوحة تماما ، استخدم 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95٪ لإزالة الآبار. ثم اترك الطبق على الخلاط لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتجنب التبخر. بعد 30 دقيقة ، سجل OD₅₄₀ على قارئ اللوحة.