طريقة لتحضير العينة لتصور البكتيريا المكونة للأغشية الحيوية على الخيوط الفطرية

أدخل مستعمرة فطرية مرتبطة بالسيلوفان في معلق بكتيري يحمل علامة الفلورسنت. قم بإزالة السيلوفان واحتضانه.

تلتصق الخلايا البكتيرية بالسطح الفطري عبر الجزيئات السطحية والمستقبلات. تفرز البكتيريا الملتصقة مواد بوليمرية خارج الخلية تتكون من السكريات والبروتينات والحمض النووي ، مما يحبس الخلايا البكتيرية ويشكل الأساس الهيكلي للأغشية الحيوية.

اشطف القسم بمحلول ملحي قوي لإزالة البكتيريا غير المرتبطة

في عازلة الفوسفات ، قم بقطع جزء من المستعمرة.

انقل القسم إلى ماء معقم يحتوي على جنين القمح agglutinin ، أو WGA المرتبط بصبغة فلورية حمراء.

يرتبط WGA ، وهو بروتين نباتي ، ببقايا N-acetylglucosamine وحمض السياليك ، مما يسمح للصبغة المرفقة بالتألق على جدار الخلية الفطرية.

شطف القسم في مخزن مؤقت الفوسفات.

اغمر شريحة جزئيا في المخزن المؤقت. دع القسم يطفو عليه. ارفعها برفق حتى يستقر القسم دون انقطاع الأغشية الحيوية.

ضع وسيطا متصاعدا ، متبوعا بغطاء للتحليل المجهري.

بعد زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 5,000 مرة جم لمدة ثلاث دقائق ، ثم قم بتعليق الحبيبات في 25 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم المعقم 0.1 مولار. بعد تكرار الطرد المركزي ، استخدم نفس المخزن المؤقت لضبط التركيز البكتيري النهائي إلى 10 إلى الخلايا التاسعة لكل مليلتر.

املأ صفيحة دقيقة مكونة من 6 آبار ب 5 مل من المعلق البكتيري. استخدم شفرة حلاقة معقمة لقطع غشاء السيلوفان للثقافة الفطرية إلى مربعات ، مع وجود مستعمرة واحدة على كل غشاء. ثم باستخدام الملقط ، قم بإزالة مربعات السيلوفان التي تحتوي على خيوط بعناية من الوسط الصلب ، وانقلها إلى الآبار الفردية للتعليق البكتيري.

رج الصفيحة الدقيقة برفق حتى تنفصل المستعمرات الفطرية عن السيلوفان. ثم قم بإزالة صفائح السيلوفان تاركة المستعمرات الفطرية في الطبق. احتضان الصفيحة الدقيقة بتحريض لطيف عند 20 درجة مئوية لبعض الوقت اعتمادا على السلالات المستخدمة والمرحلة المراد تحليلها.

بالنسبة إلى P. fluorescens BBc6 / L. ثنائي اللون ، احتضن الثقافات لمدة 30 دقيقة للحصول على أغشية حيوية في المراحل المبكرة ولمدة تصل إلى 16 ساعة للأغشية الحيوية الناضجة. لإزالة البكتيريا والبكتيريا العوالق المرتبطة إلكتروستاتيكيا بالخيوط ، اشطف الفطريات عن طريق نقلها إلى صفيحة دقيقة جديدة مكونة من 6 آبار مملوءة بمحلول ملح قوي. رج الطبق برفق لمدة 1 دقيقة.

انقل الفطريات إلى صفيحة دقيقة جديدة مكونة من 6 آبار تحتوي على 5 ملليلتر من محلول فوسفات البوتاسيوم المعقم 0.1 مولار. رج الطبق برفق لمدة دقيقتين ، ثم انقل الفطريات إلى مخزن مؤقت جديد.

مع الحفاظ على المستعمرة الفطرية في منطقة عازلة ، استخدم مشرطا لتقطيع المستعمرة إلى النصف تقريبا. انقل نصف المستعمرة المراد تلطيخها إلى طبق بتري يحتوي على 1 مليلتر من الماء المعقم المكمل بصبغة فلورية مناسبة لتصور الشبكة الفطرية ، مثل جنين القمح المتراكم مع Alexa Fluor633. ثم احتضان العينة في الظلام.

بعد التلوين ، اشطف العينة عن طريق نقلها إلى غطاء طبق بتري يحتوي على 10 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم المعقم 0.1 مولار ، ورجها برفق لمدة 1 دقيقة. اغمر نصف شريحة في غطاء طبق بتري وقم بوضع الجزء المقطوع بدقة ليطفو فوق الشريحة. بعد ذلك ، ارفع الجانب ببطء من المحلول العازل للسماح للعينة بالاستقرار برفق على الشريحة.

الجانب الأكثر حساسية هو وضع العينة على الشريحة. لتجنب اضطراب الأغشية الحيوية ، يجب غمر العينة والشريحة أثناء وضع العينة ، ويجب عدم نقل العينة بعد الآن قبل التصوير.

أخيرا ، أضف 10 ميكرولترات من وسيط التثبيت المضاد للبهتان إلى العينة وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي.