تحليل في الوقت الفعلي لهجرة الخلايا التائية المقيمة في مناطق الورم المختلفة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 4:23 د • July 8th, 2025
ابدأ بشريحة ورم الرئة تحتوي على الخلايا التائية المقيمة.
تهاجر الخلايا التائية عبر البيئة المكروية للورم وتتفاعل مع الخلايا السرطانية والعناصر اللحمية ، وتؤدي وظائف المناعة.
يؤثرتكوين البيئة المكروية للورم بشدة على إزاحة الخلايا التائية وسرعتها.
أضف أجساما مضادة متميزة مقترنة بالفلورسنت لتسمية الخلايا التائية والخلايا السرطانية والعناصر اللحمية في البيئة المكروية.
أضف DAPI ، الذي يتسلل إلى الخلايا بغشاء بلازما تالف لتلطيخ النواة ، مما يتيح تصور المناطق النخرية داخل الورم.
راقب العينة الملطخة تحت المجهر متحد البؤر.
باستخدام ضوء مضان مناسب ، حدد منطقة الورم ذات الأهمية التي تحتوي على الخلايا التائية المقيمة. تقييم صلاحية الخلية من خلال تقييم الخلايا الإيجابية ل DAPI.
للتحليل في الوقت الفعلي ، حدد الفواصل الزمنية وإجمالي وقت التسجيل.
لالتقاط صور z-stack ، ابدأ بعمق أسفل الخلايا التائية المسماة والتقط الصور على فترات زمنية مختلفة.
استخدم برنامج التتبع لمقارنة طول إزاحة الخلايا التائية ومتوسط السرعة في مناطق الورم المختلفة.
قمبتخفيف الأجسام المضادة المطلوبة المسماة بالفلورسنت والصبغة النووية الفلورية ، DAPI ، إلى التركيزات النهائية المطلوبة في وسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر. بعد ذلك ، قم بإزالة لوحة الثقافة من الحاضنة وباستخدام طرف ناعم ، قم بشفط السائل داخل غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ.
الآن ، دون لمس الشريحة ، أضف 40 ميكرولترا من الأجسام المضادة المخففة على كل شريحة ورم. للسماح بالتلوين ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد اكتمال خطوة التلوين ، باستخدام ملقط دقيق ، قم بإزالة الغسالات. ثم أخرجي الشرائح برفق واغمسيها في RPMI1640 متوسطة خالية من الفينول لمدة 10 ثوان. ضع الشرائح مرة أخرى على إدخالات زراعة الخلايا وأضف قطرة من الفينول الخالي من الأحمر RPMI1640 الوسط فوق كل شريحة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم انتقل إلى التصوير.
قبل عدة ساعات من بدء هذه التجربة ، اضبط درجة حرارة غرفة حرارة المجهر على 37 درجة مئوية ، ثم قم بإعداد المجهر الذي تم إعداده لنشر شرائح الورم باستمرار بوسط RPMI خال من الفينول المؤكسج باللون الأحمر ، وشفط المحلول إلى قارورة جمع النفايات باستخدام مضخة تمعجية.
بمساعدة ملقط ناعم ، ارفع الشريحة الملطخة من اللوحة المكونة من ستة آبار ، وانقلها إلى طبق بلاستيكي مقاس 35 ملم مملوء بوسط RPMI خال من الفينول الأحمر ، ثم ضع مرساة شريحة فوق الشريحة لدعمها. بعد ذلك ، ضع طبق بتري هذا على مرحلة التصوير بالمجهر.
بعد توصيل أطراف المدخل والمخرج لنظام التروية ، قم بتشغيل المضخة التمعجية للسماح للوسط المؤكسج بالمرور عبر أنابيب التروية. اخفض هدف الغمر في الماء إلى الشريحة ، وركز على الجزء العلوي من الشريحة بضوء المجال الساطع أو بالطول الموجي المناسب.
بعد ذلك ، باستخدام المرشحات المناسبة ، قم بتصور وتحديد منطقة الاهتمام التي تحتوي على جميع الخلايا ذات الأهمية الفلورية وهي خلايا CD8 T وجزر الورم والخلايا اللحمية الإيجابية CD90. قم بإعداد جلسة تصوير باستخدام شدة الليزر المناسبة وأوقات التعرض لتناسب سطوع إشارات الفلورسنت المرصودة. بعد ذلك ، قم بإعداد سمك المكدس Z للتصوير داخل شريحة الورم.
بعد ذلك ، حدد الفاصل الزمني لصورة Z-stack وإجمالي وقت التسجيل لالتقاط الصور في فترات زمنية محددة. بعد التقاط الصور الفلورية وتصديرها ، قم بتحليل ترحيل الخلايا التائية CD8 كما هو موضح في بروتوكول النص.
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في ديناميكيات هجرة الخلايا التائية (T cells) ضمن شرائح أورام الرئة، مع التركيز على تفاعلاتها مع الخلايا الورمية والبيئة المجهرية المحيطة. وتتضمن المنهجية استخدام الوسم الفلوري والمجهر البؤري لتصوير سلوك الخلايا التائية في الوقت الفعلي.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم المناعة
- علم الأورام
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- تلعب الخلايا التائية دوراً حاسماً في الاستجابة المناعية ضد الأورام.
- تؤثر البيئة الدقيقة للورم بشكل كبير على سلوك الخلايا التائية.
- يمكن أن يساهم فهم ديناميكيات الخلايا التائية في تطوير استراتيجيات العلاج المناعي للسرطان.
- يسمح الوسم الفلوري بالملاحظة الدقيقة للتفاعلات الخلوية.
الغرض من الدراسة
- لتحليل أنماط هجرة الخلايا التائية داخل أورام الرئة.
- لتقييم تأثير البيئة المجهرية للورم على إزاحة الخلايا التائية وسرعتها.
- لاستخدام تقنيات تصوير متقدمة للمراقبة في الوقت الفعلي.
الطرق المستخدمة
- تحضير شرائح أورام الرئة التي تحتوي على خلايا T مقيمة.
- الوسم الفلوري لخلايا T، والخلايا الورمية، والعناصر السدوية.
- استخدام المجهر البؤري (Confocal microscopy) لتصوير وتحليل ديناميكيات الخلايا.
- استخدام برامج التتبع لتقييم إزاحة وسرعة خلايا T.
النتائج الرئيسية
- كشف التصوير في الوقت الحقيقي عن أنماط هجرة متميزة للخلايا T.
- أثرت البيئة المجهرية للورم على سرعة الخلايا T وإزاحتها.
- ساهم الوسم الفلوري بفعالية في تسليط الضوء على المناطق التنخرية والتفاعلات الخلوية.
- قدم تحليل البيانات رؤى حول سلوك الخلايا T في مناطق الورم المختلفة.
الاستنتاجات
- تعزز هذه الدراسة فهم ديناميكيات الخلايا التائية في أورام الرئة.
- قد تساهم النتائج في تطوير علاجات مناعية موجهة.
- تعد تقنيات التصوير في الوقت الحقيقي ذات قيمة عالية لدراسة الاستجابات المناعية في الأورام.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
يوفر التصوير البؤري الزمني الحقيقي لهجرة خلايا CD8 T المقيمة في شرائح أورام الرئة البشرية رؤى قابلة للتطبيق حول ديناميكيات الخلايا المناعية داخل البيئة المجهرية للورم. تتيح هذه القدرة تقليل المخاطر الميكانيكية والتحقق من الأهداف لبرامج المناعة الورمية، مما يدعم الثقة التنبؤية عند الواجهة الاستكشافية والترجمية. وتعمل مقاييس الهجرة الكمية على توجيه قرارات المحفظة من خلال توضيح مستوى الاشتباك المناعي وحواجز البيئة المجهرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء المباشر للتفاعلات بين الخلايا التائية والأورام، وبين الخلايا التائية والسدى في الموقع.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال قياس إزاحة الخلايا المناعية وسرعتها.
- يوفر تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف المعدِّلة للمناعة ضمن سياقات نسيجية معقدة.
- يسهل تعزيز الثقة التنبؤية في فرضيات الارتباط المناعي.
الفحص وتطوير المقايسة
- إنشاء أنظمة شرائح ورمية خارج الجسم (ex vivo) تم التحقق من صحتها لاستخدامها في اختبارات هجرة الخلايا المناعية اللاحقة.
- تقديم قراءات كمية وقابلة للتكرار لحركية الخلايا التائية عبر مناطق الورم.
- تمكين توحيد سير عمل التصوير والتحليل لتتبع الخلايا المناعية.
- دعم فحص المركبات أو المواد البيولوجية التي تعدل هجرة الخلايا المناعية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يوائم مقاييس هجرة الخلايا المناعية مع البيئات الدقيقة للأورام البشرية ذات الصلة بالمرض.
- يربط نتائج الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال الحفاظ على بنية الأنسجة وتغايرها.
- يوجه التقدم المعدل وفقاً للمخاطر لأصول الأورام المناعية بناءً على القراءات المناعية الوظيفية.
- يدعم تطوير المؤشرات الحيوية الانتقالية لارتشاح الخلايا المناعية ونشاطها.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يدمج سير عمل التصوير والتحليل هذا المراحل بدءاً من الاكتشاف المبكر وصولاً إلى الأبحاث الانتقالية، مما يتيح اختبار الفرضيات بشكل تكراري وتقليل المخاطر الميكانيكية في مسارات تطوير العلاجات المناعية للأورام.
- بيولوجيا الاكتشاف: تقييم كمي لهجرة الخلايا التائية وتفاعلها مع أقسام الورم والسدى لتوضيح المسارات.
- الفحص المسحي: توفير اختبارات هجرة كمية ومعيارية لمعدلات الخلايا المناعية.
- التحليلات: إنشاء مقاييس الإزاحة والسرعة لإجراء مقارنات إحصائية قوية عبر مناطق الورم.
- الأبحاث الانتقالية: الحفاظ على سياق الأنسجة البشرية لضمان الاستمرارية في الدراسات قبل السريرية ومواءمة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفير منصة ex vivo قابلة لإعادة الاستخدام لدراسات هجرة الخلايا المناعية عبر برامج متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الآلي في استهداف الخلايا المناعية.
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل موحد وقابل للتكرار للتصوير والتحليل في دراسات الهجرة المناعية.
- القيمة الاستراتيجية: ترشد قرارات المضي قدماً أو التوقف وتخصيص رأس المال من خلال توضيح المشاركة المناعية في أنسجة الأورام البشرية.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لأصول العلاج المناعي للأورام بناءً على المقاييس المناعية الوظيفية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في المجهر البؤري (confocal microscopy) والتعامل مع الأنسجة الحية.
- يستلزم الوصول إلى منصات تصوير متقدمة وبرامج تتبع.
- يستوجب توحيد معايير بروتوكولات الصبغ والتصوير والتحليل بين الفرق المختلفة.
- قد يلزم إجراء مواءمة لأنواع الأورام المختلفة أو مجموعات الخلايا المناعية.
- يمكن أن تحد الحيوية وجودة الأنسجة من إمكانية تكرار الاختبار وتفسير نتائجه.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
استخدام تكنولوجيا MHC سلسلة واحدة للتحقيق في أجونيسم Co في البشرية CD8 + تي خلية التنشيط
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الرصد في الوقت الحقيقي للتنفس الميتوكوندريا في الخلايا التائية الأولية البشرية المتباينة بالسيتوكين
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تصوير هجرة الخلايا السرطانية في أنسجة الورم الأرومي الدبقي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح الضوئي بفاصل زمني
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات APC مين / + الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
التصوير CD4 T خلية الخلالية الهجرة في الأدمة الملتهبة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
![السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55709.jpg%3Fv%3D2026-08-27T11%253A38%253A21.000Z&w=384&q=75)
السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الدراسة المتزامنة لتجنيد الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تحت التدفق في الأنابيب
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
التصور، القياس الكمي، ورسم خرائط للخلايا المناعية في البيئة الدقيقة الورم
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 22 أغسطس 2026