موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 4:11 دقيقة • July 8th, 2025
خذ مزرعة خلايا الثدييات التي تعبر عن مجال تكرار بروتين تاو المرتبط بالأنابيب الدقيقة.
يمتلك مراسلو تاو السيتوبلازميون طفرة معرضة للتجميع ويتواجدون كمونومرات.
يتم دمج المراسلين إما في الفلوروفور A أو B ، مع تداخل طيف الانبعاث الأول مع طيف امتصاص الأخير.
أضف الجسيمات الشحمية المعقدة ببذور تاو أو الركام الليفي من تاو كامل الطول.
عند دخول الخلية ، يطلق الجسيم الشحمي البذور في السيتوبلازم.
تتوسط البذور التي تم إطلاقها في تجميع مراسلي تاو ، مما يجعل الفلوروفور A بالقرب من الفلوروفور B.
أضف التربسين لفصل الخلايا ، ثم قم بإجراء التثبيت.
تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
نظرا للقرب داخل الركام ، عند الإثارة ، يشار إلى نقل الطاقة من الفلوروفور A إلى B عبر تفاعل ثنائي القطب ثنائي القطب باسم نقل طاقة الرنين الفلوري أو FRET.
يصدر الفلوروفور B المتحمس إشارة FRET ، يشير وجودها إلى تراكم البروتين.
لإعادة طلاء خلايا المستشعر الحيوي في ظل ظروف معقمة ، اشطف كل خط خلية باستخدام PBS دافئ متبوعا بحضانة لمدة 3 دقائق باستخدام Trypsin-EDTA. عندما تنفصل الخلايا ، أوقف التفاعل بوسط الثقافة الدافئة ، وانقل الخلايا على الفور إلى أنبوب مخروطي الشكل.
الطرد المركزي للخلايا ، وإعادة تعليق الحبيبات في وسط جديد. بعد ذلك ، قم بحساب الخلايا وقم بعمل تخفيف خلية Mastermix من 3،500،000 خلية لكل 13 مل من الوسط. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل ببطء 130 ميكرولترا من الخلايا إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة ذات القاع المسطح مع الحرص على وضع أطراف الماصة في وسط الآبار دون لمس قاع اللوحة.
بمجرد طلاء الخلايا ، اتركها تستقر دون إزعاج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتضن اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، وأكبر من أو تساوي 80٪ رطوبة نسبية. في اليوم التالي عندما تكون خلايا المستشعر الحيوي متقاربة بنسبة 60٪ إلى 65٪ ، تجمع بين وسط المصل المنخفض ، وكاشف الجسيمات الشحمية ، ومصدر البذور البيولوجي لعمل مجمعات التنبيغ.
بعد ذلك، قم بإخراج 20 ميكرولترا من مركب التنبيغ برفق أسفل جانب كل بئر مستشعر حيوي فردي وأعد الخلايا المعالجة إلى الحاضنة لمدة 24 إلى 48 ساعة أخرى. قبل الحصاد ، ستظهر الخلايا غير المعالجة مضان منتشر فقط. ومع ذلك ، فإن الخلايا المعالجة بمادة بذور تاو ستظهر مجاميع ساطعة بعد 1 إلى 2 أيام.
لحصاد الخلايا ، استبدل وسط زراعة الخلايا ب 50 ميكرولتر من Trypsin-EDTA ، وأوقف التفاعل بعد 5 دقائق ب 150 ميكرولتر من وسط الاستزراع المبرد. على الفور ، انقل الخلايا إلى صفيحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا وحبيبات الخلايا. قم بشفط المادة الطافية دون إزعاج الكريات ، ثم أعد تعليق الخلايا برفق ولكن تماما في 50 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي المبرد.