JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 4:37 د • July 8th, 2025
علاج الثقافات العصبية بتركيزات متزايدة من سم الاختبار.
يدخل السم إلى الخلايا ويتم إطلاقه في العصارة الخلوية.
اعتمادا على إمكاناته ، قد يمنع السم الاندماج الحويصلي ، مما يثبط إطلاق الناقل العصبي.
استبدل الوسط بمخزن مؤقت يحتوي على مركبات دوائية عصبية محددة لمنع إمكانات عمل الخلايا العصبية.
ضع طبق الثقافة على مرحلة الفيزيولوجيا الكهربية. لبدء التسجيل، قم بتوصيل سوما الخلايا العصبية بماصة تحتوي على قطب كهربائي للتسجيل.
قم بتطبيق ضغط سلبي ثابت لشفط جزء غشائي صغير ، لتشكيل جيجاسيل ، وهو ختم محكم يضمن الحد الأدنى من التداخل أثناء التسجيل.
حافظ على جهد غشاء ثابت لقياس التيارات العصبية.
استخدم نبضات الضغط السلبي لتمزق الغشاء ، مما يؤدي إلى إنشاء اتصال مباشر بين الخلايا العصبية والماصة.
سجل التيارات المنتجة في الخلايا العصبية بسبب امتصاص الناقلات العصبية ، والتي تسمى mEPSCs.
يشيرانخفاض تردد mEPSC مع زيادة التعرض للسموم إلى تثبيط إطلاق الناقل العصبي.
يخفف النمط المصلي للسموم العصبية البوتولينوم A إلى 100 مرة التركيز النهائي المطلوب في وسط ثقافة ESN ودافئ إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف حجما مناسبا من السم إلى ثقافات DIV 21+ ESN. قم بتدوير طبق الثقافة والعودة إلى الحاضنة.
في النقطة الزمنية المطلوبة ، قم بسحب وسيط ثقافة ESN ، واغسله مرتين باستخدام مخزن التسجيل خارج الخلية أو ERB. ثم, إضافة 4 ملليلتر من ERB مع 5 السموم الرباعية micromolar لمنع إمكانات العمل و 10 micromolar bicuculline لمعاداة نشاط مستقبلات GABAA. بعد ذلك ، انقل الطبق إلى جهاز الفيزيولوجيا الكهربية. لا يلزم التروية أو التحكم في درجة الحرارة للتثبيط المقاس للانتقال المشبكي أو مقايسة MIST.
بعد استخدام مجتذب ماصة دقيقة لسحب ماصات البورسليكات بمقاومة تتراوح من 5 إلى 10 ميغا أوم، قم بإعادة ملء الماصة بمخزن مؤقت للتسجيل داخل الخلايا. ثم اغمس الماصة برفق في كاشف السيليكون. قم بتثبيت ماصة التسجيل على حامل القطب الكهربائي وقم بتوصيل حقنة مملوءة بالهواء بالأنبوب الذي يتم نقله في حامل القطب. قم بتوفير ضغط إيجابي ثابت عبر المحقنة أثناء خفض ماصة التسجيل في ERB.
بعد هبوط ماصة التسجيل برفق على سوما الخلية العصبية المراد تسجيلها ، استولى على الضغط الإيجابي عن طريق كسر الختم الموجود على المحقنة. أعد توصيل المحقنة وقم بالضغط السلبي المستمر من خلال الإلهام اللطيف لتشكيل ختم جيجا أوم. بمجرد تشكيل ختم الجيجاأوم ، قم بتقليل جهد التثبيت إلى 70 مللي فولت تحت الصفر ، ثم قم بتطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي بعناية باستخدام المحقنة لاقتحام تكوين الجملة.
راقب ارتفاعات السعة لمدة 30 ثانية للتأكد من استقرار التصحيح. قم بإلغاء طفرات السعة في برنامج القراصنة ، وقم بالتبديل إلى وضع المشبك الحالي لمراقبة وتسجيل إمكانات غشاء الراحة. بدون تعديل لإمكانات الوصلة السائلة ، يجب أن تكون إمكانات غشاء الراحة بين سالب 67 و 82 مللي فولت تحت الصفر.
اضبط الكسب على 2 مللي فولت لكل بيكوأمبير. قم بالتبديل إلى وضع مشبك الجهد وقم بإجراء ناقص مستمر 70 مللي فولت ، والتسجيل لمدة 3 إلى 5 دقائق للكشف عن التيارات المثيرة المصغرة بعد المشبكي.
قم بتحليل البيانات المسجلة من 3 إلى 5 دقائق للكشف عن MEPSCs باستخدام الإعدادات الافتراضية ل EPSCs لمستقبلات AMPA في التحليل المصغر. جمع المعلومات عن الأحداث المكتشفة وحفظها. بعد جمع ترددات mEPSC ل 8 إلى 12 عنصر تحكم و 8 إلى 12 عينة معالجة بالسموم العصبية البوتولينوم لكل حالة تعرض ، قم بتحليل التردد مقابل العمر والضوابط المتطابقة.