إنتاج وتنقية الأجسام المضادة المؤتلفة من خلايا الثدييات

ابدأ بأنبوب يحتوي على نواقل منفصلة لجينات الأجسام المضادة ثقيلة السلسلة والسلسلة الخفيفة.

أضف كاشف تعداء لتشكيل مجمعات مع المتجهات.

انقل هذا المزيج إلى الخلايا المضيفة للثدييات واحتضانه للاستيعاب.

أضف عاملا مضادا للتكتل لتعزيز التوزيع المتساوي للخلايا المنقولة ، مما يحسن استعادة الخلايا ونموها.

أضف محلولا مضادا للبكتيريا والفطريات لمنع التلوث.

داخل الخلية المضيفة ، تندمج النواقل في جينوم المضيف.

بعد النسخ الجيني ، تخرج mRNAs الفردية من النواة وتخضع للترجمة لتشكيل سلاسل الأجسام المضادة الناشئة.

يؤدي

الطي والتعديل الصحيح للسلاسل الناشئة إلى سلاسل ثقيلة وخفيفة.

تتحد هذه السلاسل لتشكيل أجسام مضادة تعمل بكامل طاقتها ، والتي يتم إطلاقها بعد ذلك في وسط خارج الخلية.

حصاد الوسط وأجهزة الطرد المركزي. تصفية المادة الطافية.

مرر المرشح عبر عمود تنقية يسمح بالارتباط الانتقائي للأجسام المضادة.

باستخدام مخزن مؤقت للشطف ، قم بإزالة الأجسام المضادة المنقاة.

تنمو خلايا CHO في 200 مل من الوسائط إلى قوارير طويلة محيرة Erlenmeyer. اجمع بين 5 ملليلتر من وسائط CHO الحرة مع 50 ميكروغراما من الحمض النووي المستنسخ الثقيل المتغير و 75 ميكروغراما من الحمض النووي المستنسخ الخفيف المتغير في أنبوب سعة 15 ملليلترا. ثم ، قم بدوامة الأنبوب. اتركي الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أضف 750 ميكرولتر من 1 ملليغرام لكل مليلتر من مخزون البولي إيثيلين أمين إلى محلول الحمض النووي ، وقم بدوامه بقوة لمدة 30 ثانية.

اترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق إضافية. أضف الخليط بالكامل إلى خلايا CHO أثناء رج القارورة يدويا. احتضان الخلايا على الفور عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة.

في اليوم التالي ، أضف 2 مليلتر من عامل مضاد للتكتل 100x و 2 مل من محلول مضاد للبكتيريا مضاد للبكتيريا 100x إلى الخلايا. احتضان القوارير عند 32 إلى 34 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة. استمر في زراعة الخلايا لمدة 10 إلى 11 يوما ، مع إضافة 10 مل من تغذية التربتون N1 و 2 ملليلتر من مكمل الجلوتامين 100x في كل يوم خامس. عد الخلايا كل يوم ثالث للتأكد من بقاء صلاحية الخلية أعلى من 80٪. في اليوم 10 أو 11 ، قم بحصاد وسط تنقية الأجسام المضادة عن طريق الطرد المركزي للثقافة عند 3,000 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 40 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتصفية الوسائط الشفافة باستخدام مرشح زجاجة 0.22 ميكرومتر.

لتنقية الأجسام المضادة ، قم بموازنة عمود البروتين A بمجلدين من المخزن المؤقت المرتبط. قم بتمرير الوسائط التي تمت تصفيتها عبر العمود بمعدل تدفق 1 مليلتر في الدقيقة. ثم اغسل العمود بمجلدين من المخزن المؤقت الملزم. استخدم 5 ملليلتر من محلول الشطف لتصفية الجسم المضاد إلى أجزاء 500 ميكرولتر.