موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 2:28 دقيقة • July 8th, 2025
خذ عمود FPLC يحتوي على راتنج زجاجي مسامي مع بروتين A الثابت - وهو بروتين بكتيري مرتبط بالأجسام المضادة. قم بموازنة العمود بمخزن مؤقت محايد للأس الهيدروجيني.
أضف سائل زراعة الخلايا الذي تم حصاده من خلايا مبيض الهامستر الصينية، والذي يحتوي على أجسام مضادة وحيدة النسيلة وبروتينات وحمض نووي ملوث.
يرتبط البروتين أ بمنطقة Fc للجسم المضاد ، مما يؤدي إلى شل حركتها.
بعض الملوثات ترتبط بالراتنج بشكل غير محدد ، بينما يتدفق الباقي من خلاله.
في الكروماتوجرام ، يشير امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المتزايد أثناء تحميل العينة إلى تركيز مرتفع من البروتين في التدفق من خلاله.
يغسل بمخزن التوازن لإزالة الملوثات غير المرتبطة ، ويشار إليها بانخفاض في الامتصاص.
اغسل بمخزن مؤقت عالي الملح ، مما يؤدي إلى تعطيل التفاعلات غير المحددة وإزالة الملوثات ، المشار إليها بذروة الشوائب الصغيرة.
أضف مخزلا مؤقتا للشطف منخفض الأس الهيدروجيني لتعطيل تفاعل الجسم المضاد للبروتين A والتخلص من الأجسام المضادة ، والتي يتم جمعها عن طريق تتبع الذروة المقابلة.
قم بتحييد درجة الحموضة للأجسام المضادة المجمعة لمنع التدهور.
ابدأ بفتح البرنامج المتصل بنظام التنقية ووضع أنابيب مخروطية سعة 15 مليلتر لجمع تصفيف الجسم المضاد المنقى ، وأنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر لتجميع التدفق أثناء الغسيل عالي الملح في مجمع الكسور.
بعد ذلك ، أضف سائل ثقافة الخلايا المحصودة المصفاة بالمسام بحجم 0.22 ميكرومتر إلى حقنة فارغة سعة 12 مليلتر مع فوهة مغطاة بعد إزالة الغطاء ، أدخل فوهة المحقنة في منفذ الحقن اليدوي لنظام التنقية. قم بلف المحقنة لإحكام ربطها في مكانها ، واضغط على المكبس حتى يتم حقن الحجم الكامل للعينة ، ويكون مرئيا في حلقة العينة كبيرة الحجم سعة 10 ملليلتر.
حدد الطريقة المحفوظة وانقر فوق تشغيل عندما يطلب منك برنامج الأداة. عندما يتم التخلص من كل الجسم المضاد ، قم على الفور بتحييد البروتين المنقى باستخدام 1 قاعدة تريس مولار إلى درجة حموضة تبلغ حوالي 5.5.