اختبار للكشف عن الأجسام المضادة الذاتية في المصل البشري باستخدام مزرعة الخلايا العصبية في الحصين

خذ الفئران جنين الحصين.

أضف التربسين. احتضان للتوسط في انهيار مصفوفة الأنسجة ، وتخفيف خلايا الحصين.

تمييع مع عازلة. احتضن لاستمرار الهضم الأنزيمي مع التربسين.

بعد ذلك ، انقل كتلة الأنسجة إلى أنبوب يحتوي على الوسائط. الماصة بشكل متكرر للتفكك الميكانيكي في خلايا مفردة.

خلايا البذور على أغطية مطلية ببولي إل ليسين داخل ألواح الاستزراع.

حضن. تلتصق خلايا الحصين بالأسطح المطلية. تطور الخلايا العصبية صفيحة وتمتد الأعصاب الثانوية.

علاوة على ذلك ، تنمو الخلايا العصبية مع العمليات المحورية والتغصنية ، وتشكل شبكة عصبية.

الخلايا العصبية الناضجة التعبير عن مستقبلات ضادات متشابك, مستقبلات N-Methyl -D-aspartate, أو NMDARs.

بعد الحضانة ، اغسل أغطية الوسائط.

أضف مصل مريض التهاب الدماغ المناعي الذاتي المخفف. ترتبط الأجسام المضادة الذاتية ب NMDARs العصبية.

اغسل بالعازلة ثم قم بإصلاح الخلايا.

أضف الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروفور والتي ترتبط بالأجسام المضادة الذاتية المرتبطة ب NMDAR.

يغسل مع العازلة. ضع الغطاء فوق وسائط التثبيت التي تحتوي على DAPI لتلطيخ النوى.

يراقب الإشارات الفلورية على الخلايا العصبية مجهريا ، مما يشير إلى وجود أجسام مضادة ذاتية في المصل.

من أجل التفكك الأنزيمي للحصين عند 1 مليلتر من 2.5٪ التربسين في أنبوب 50 مليلتر يحتوي على الحصين ، بعد رفع الحجم في الأنبوب إلى 5 ملليلتر مع HBSS ، احتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية. لتخفيف التربسين بشكل أكبر ، أضف 10 مل من HBSS المسخن مسبقا ، ثم ضع الأنبوب مرة أخرى في الحمام المائي المثبت على 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

بعد ذلك ، استخدم ماصة دقيقة سعة 1000 ميكرولتر لنقل الحصين الذي يظهر ككتلة مخاطية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، واحتضان الأنسجة ب 6 ملليلتر من HBSS المسخن مسبقا لمدة 5 دقائق ، كما هو موضح. لفصل الأنسجة ميكانيكيا ، انقل كتلة الحصين إلى أنبوب 2 مليلتر ذو قاع مخروطي. بعد إضافة 1 مليلتر من وسائط DMEM المسخنة مسبقا ، قم بتجانس الحبيبات باستخدام ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر عن طريق الشفط برفق لأعلى ولأسفل.

تأكد من عدم تكوين فقاعات، كرر الشفط لأعلى ولأسفل من 10 إلى 20 مرة باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة مسبقا، بحيث يكون طرفها ملامسا للقاع المخروطي للأنبوب، حتى يصبح الخليط شفافا. عد الخلايا قبل توزيعها بالتساوي على طبق طوله 3.5 سم بحركات اهتزاز متقاطعة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع الطبق في الحاضنة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

للتلطيخ المناعي الفلوري للخلايا المختبرية لمدة 14 يوما ، أضف العينة التي تحتوي على أجسام مضادة مضادة ل NMDAR إلى الغطاء ، واحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ساعة واحدة ، عالج العينة بالفورمالديهايد بنسبة 4٪ في PBS ، كمحلول تثبيت ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها ، متبوعا بإضافة الأجسام المضادة الثانوية للماعز المضادة للإنسان Alexa Fluor 488 عند تخفيف من 1 إلى 1,000 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتركيب الغطاء الذي يحتوي على العينة بوسط تركيب السائل ، واستنشق أي سائل متبقي.