اختبار لقياس عيار الأجسام المضادة المعادلة الخاصة بالفيروس المخلوي التنفسي

تناول مصل بشري مخفف متسلسلا ومعطل حراريا يحتوي على فيروس مخلوي تنفسي أو أجسام مضادة معادلة خاصة بفيروس مخلوي التنفس.

أضف المعلق الفيروسي. تعمل الأجسام المضادة على تحييد الفيروسات بطريقة تعتمد على التخفيف.

أدخل الخليط إلى الطبقات الأحادية للخلايا الظهارية البشرية واحتضان لامتصاص الفيروس.

تخلص من الخليط. أضف الوسائط المحتوية على كربوكسي ميثيل السليلوز ، لتشكيل تراكب شبه صلب. حضن.

يستخدم RSV آلية الخلية المضيفة لتصنيع الحمض النووي الريبي الفيروسي والبروتينات ، والتي تتجمع لاحقا وتتبرعم كفيروسات فردية.

تموت الخلايا المصابة في النهاية. يقيد كربوكسي ميثيل السليلوز حركة الفيروس ، مما يتسبب في عدوى موضعية وموت الخلايا ، ويشكل لويحات.

قم بإزالة التراكب.

قم بإصلاح الخلايا باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على الأسيتون. أدخل حاجزا حاجب يحتوي على المنظفات لاختراق الخلايا ومنع تفاعلات الأجسام المضادة غير المحددة.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف البروتينات الفيروسية.

تراكب مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية.

قم بتصوير الآبار لتحديد لويحات الفلورسنت.

أعلى تخفيف في الدم يحيد خمسين بالمائة من RSV يمثل عيار التحييد.

قبل تلقيح خلايا A549 ب RSV ، افحص صفيحة الخلية تحت مجهر ضوئي للتأكد من أن الطبقات الأحادية للخلية A549 ملتقية بنسبة 80٪. بعد ذلك ، اقلب اللوحة برفق للتخلص من الوسائط ، وامسح اللوحة برفق على منشفة ورقية معقمة وماصة. بعد كل غسلة مع PBS مصفى ومعقم.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من خليط مصل الفيروس إلى الآبار المقابلة على صفيحة الخلية A549 وفقا لقالب اللوحة الوارد في المخطوطة ، واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، استخدم ماصة لإزالة 90 ميكرولتر لكل بئر ، وأضف 100 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على 1X M 199 و 1.5٪ CMC و 2٪ FCS وخليط البنسلين والستربتومايسين. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام.

لإصلاح لوحة الفحص وتطويرها ، قم أولا بقلب لوحة خلية A549 المصابة ب RSV برفق للتخلص من الوسائط التي تحتوي على M 199 و CMC و 2٪ FCS وخليط البنسلين والستربتومايسين. ثم أضف ببطء 200 ميكرولتر من مخزن التثبيت إلى كل بئر. احتضن الطبق عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، تخلص من المخزن المؤقت للتثبيت ، وامسح برفق على منشفة ورقية ماصة.

اترك الطبق ووجهه لأسفل حتى يجف لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، باستخدام المخزن المؤقت PBS المصفى الذي يحتوي على 0.05 بولي سوربات -20 ، اصنع محلول مانع للحليب بنسبة 5٪. أضف 200 ميكرولتر من محلول الحجب إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، اقلب اللوحة برفق للتخلص من المحلول ، وامسح منشفة ورقية ماصة.

لصنع الجسم المضاد الأساسي ، قم بتخفيف 1 إلى 500 جسم مضاد من Goat X RSV في محلول الحظر. أضف 50 ميكرولترا إلى كل بئر ، واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام بولي سوربات PBS المصفى.

بعد ذلك ، اصنع الجسم المضاد الثانوي عن طريق تخفيف 1 إلى 5,000 من الغلوبولين المناعي المضاد للماعز من AlexaFluor Donkey G في محلول الحظر. أضف 50 ميكرولترا إلى كل بئر ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اغسل الطبق خمس مرات باستخدام بولي سوربات PBS المصفى.

لعد اللوحات باستخدام قارئ البقع الآلي ، أولا ، استخدم لوحة ثقافة 96 بئرا غير مستخدمة لمعايرة الأداة عن طريق إدخال إعدادات العد في قناة FITC. ثم اقرأ لوحة الخلية ولفها بورق الألمنيوم وقم بتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، تحقق من صور الآبار بحثا عن لويحات مصطنعة أو طبقات أحادية الخلية المعطلة ، واستبعد الآبار ذات الطبقات الأحادية للخلايا المعطلة.