البيوفيزيائية فحوصات للتحقيق في الخواص الميكانيكية للنواة الخلية الطور البيني : الركيزة التطبيق الانفعال والتلاعب Microneedle

الهدف العام من التجارب التالية هو قياس الخصائص الميكانيكية لنواة الخلية واتصالها الفيزيائي بالهيكل الخلوي المحيط بها. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تسليط إجهاد ميكانيكي على خلايا مزروعة على غشاء سيليكون شفاف وتصوير التشوهات النووية الناتجة. حيث تشير زيادة التشوهات النووية إلى انخفاض صلابة النواة، نظراً لأن التغيرات في الترابط بين النواة والهيكل الخلوي يمكن أن تؤثر أيضاً على التشوهات النووية المستحثة.

يتم استقصاء انتقال القوة داخل الخلايا بين الهيكل الخلوي والنواة مباشرةً عن طريق تطبيق إجهاد موضعي على الهيكل الخلوي. ثم يتم تصوير إزاحة الهياكل النووية والخلوية المحددة بصبغات فلورية. وتُستخلص من ذلك نتائج توضح صلابة نوى الخلايا بالنسبة للهيكل الخلوي المحيط بها.

بناءً على تجارب إجهاد الركيزة، يكشف مقايسة التلاعب بالإبر المجهرية أن تعطل الاقتران بين النواة والهيكل الخلوي يتسبب في عيوب في نقل القوة داخل الخلايا. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنيات مقارنة بالطرق الحالية، مثل شفط الأنابيب المجهرية للنوى المعزولة، في أنها تسمح بقياس ميكانيكا النواة في خلايا حية سليمة دون الإخلال بالبنية الخلوية الطبيعية. ويمكن لهذه الطرق أن توفر رؤى حول كيفية تأثير التغيرات في تكوين الغلاف النووي على الخصائص الميكانيكية للنواة.

ويمكن تطبيقها أيضاً لدراسة دور الميكانيكا النووية في سياق أمراض مثل الاعتلالات العصبية المرتبطة بـ LA أو السرطان. يتكون كل طبق شد من طبق بلاستيكي مخصص بدون قاع بقطر ثلاث بوصات وحلقة دائرية بلاستيكية (O-ring) لتثبيت غشاء سيليكون، والذي يعمل كركيزة لزراعة الخلايا. ولتحضير طبق الشد، قم بتثبيت قطعة من غشاء السيليكون مقاس أربع بوصات في أربع بوصات بين الحلقة الدائرية والطبق، ثم قص الغشاء الزائد بعناية، واشطف طبق الشد بالماء منزوع الأيونات، ثم قم بتعقيم الطبق بجهاز الموصدة (autoclave) قبل طلاء غشاء السيليكون بجزيئات المصفوفة خارج الخلوية، مع وضع نقطة مرجعية على الجزء الخارجي من الغشاء في المنتصف السفلي.

ستساعد هذه العلامة المرجعية في تحديد الخلايا نفسها أثناء تجارب الإجهاد لتطبيق الإجهاد أحادي المحور. يتم وضع شريطان متوازيان من الشريط اللاصق حول النقطة المرجعية لتقييد تكوين الغشاء في بُعد واحد. ولضمان الالتصاق الأمثل للخلايا، يتم طلاء أغشية السيليكون بـ 3 µg/mL من الفيبرونيكتين أو أي من بروتينات المصفوفة خارج الخلوية المناسبة.

قم بتغطية طبق التصفية بطبق بوليسترين مقلوب بقطر 10 سنتيمتر، واحضنه طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في اليوم التالي. اشطف الغشاء مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة البروتين الزائد. املأ الطبق بـ 10 milliliters من وسط النمو واتركه جانباً.

بمجرد تحضير طبق غشاء السيليكون المغطى، يتم فصل الخلايا باستخدام trypsin بتركيز 0.05% ثم يتم استزراع الخلايا الملتصقة في الطبق في وسط نمو. يتم توضيح هذا الإجراء باستخدام خلايا جنينية من الفأر.

يتم تحضين الخلايا الليفية (Fibroblasts) أو خلايا mes لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة تحت ظروف زراعة طبيعية. يتكون المجهر المقلوب المجهز لتجارب إجهاد الركيزة من جهاز إجهاد يتألف من لوحة قاعدة تثبت على منصة المجهر. وتحمل هذه اللوحة بلاتينًا أسطوانيًا مركزيًا، يعمل على تسليط الإجهاد على القسم المركزي من غشاء السيليكون.

يحتوي الجهاز أيضاً على لوحة متحركة تثبت طبق الشد ويمكنها الانزلاق للأعلى والأسفل على أربعة دبابيس توجيه، بالإضافة إلى وزن قدره خمسة أرطال لتطبيق الحمل. ومن أجل تصور النوى، يتم تحضين الخلايا في طبق الشد مع 1 µg/mL من صبغة hooked لمدة 15 دقيقة عند 37 °C. وبعد التحضين، يتم سحب الوسط واستبداله بـ 15 mL من وسط نمو خالٍ من الفينول الأحمر يحتوي على 25 mM من heis.

ثم قم بربط الطبق في حامل الأطباق ووضع الشحم بعناية على محيط الجزء السفلي من الغشاء السيليكوني لضمان انزلاق الغشاء على طول البلاتين المركزي. تأكد من إبقاء القسم المركزي من الغشاء خالياً. ضع لوحة القاعدة على لوحة منصة المجهر وقم بتركيب حامل الأطباق بعناية على لوحة القاعدة.

تأكد من أن الغشاء السيليكوني لطبق الإجهاد يستقر بشكل فضفاض على الصفيحة المركزية في وضع الراحة الأولي. بعد ذلك، ركز على الجزء السفلي من الغشاء السيليكوني وحدد نقطة المرجع السوداء المركزية. ستعمل هذه النقطة كنقطة بداية لجميع عمليات التقاط الصور وتساعد في تحديد موقع الخلايا نفسها أثناء عملية التمدد وبعدها.

في هذه الصورة، تملأ النقطة المركزية كامل مجال الرؤية. بدءاً من حافة النقطة، اضبط التركيز لرؤية الخلايا والجزء العلوي من غشاء السيليكون. حدد الخلايا المتباعدة جيداً والتي تتوسطها النوى.

التقط صورة تباين وجهي (face contrast)، والتي يجب أن تركز على الخط الخارجي للخلية والغشاء السيليكوني. ثم التقط صورة فلورية لصبغة الخطاف النووي (nuclear hook stain)، والتي يجب أن تركز على المستوى المركزي للنواة. بعد التقاط صور لخمس إلى 15 خلية، عُد إلى النقطة المركزية.

ضع الثقل ببطء على طبق الإجهاد مما يؤدي إلى تطبيق إجهاد منتظم في مركز الطبق. يتم تحديد الحد الأقصى لإجهاد الركيزة المطبق بواسطة فواصل نايلون موضوعة على دبابيس المحاذاة الرأسية بعد تطبيق الإجهاد، ركز على الجزء السفلي من غشاء السيليكون وحدد نقطة المرجع مرة أخرى، بدءًا من النقطة.

أعد تحديد موقع الخلايا ذاتها، وقم مرة أخرى بالتقاط صورة تباين طوري، وصورة فلورية لنواة كل خلية تحت إجهاد كامل، مع محاولة مطابقة المستويات البؤرية للصور الأولية بدقة. يجب ألا تتجاوز هذه العملية 10 دقائق لتجنب إعادة التشكيل النشط وتكيف الخلية مع الركيزة الغريبة. بعد الحصول على جميع الصور المقابلة، أعد منصة المجهر إلى نقطة البداية.

أزِل الثقل بعناية من لوحة حامل الطبق واترك الغشاء السيليكوني ليرتخي إذا لزم الأمر. ادفع طبق الترشيح بلطف إلى الأعلى حتى يعود إلى موضعه الأصلي. بعد ذلك، قم بالحصول على صور تباين الطور والفلورية.

تُحلل صور الخلايا بعد تعريضها للإجهاد، تماماً كما هو موضح في صور الإجهاد، وصور الخلايا والنوى المحددة بفلورسنت قبل وأثناء وبعد تطبيق الإجهاد، وذلك لحساب الإجهاد النووي المعياري. في هذا العرض التوضيحي، يُستخدم برنامج MATLAB مكتوب خصيصاً للتحليل، ولكن تتوفر عدة خيارات بديلة لحساب إجهاد الركيزة المطبق يدوياً عن طريق مطابقة مواقع من ثلاث إلى ست نقاط تحكم تقع على الغشاء بين الصور المقابلة قبل الإجهاد الكامل وبعده. ثم يقوم برنامج MATLAB بحساب إجهاد الغشاء المطبق من خلال مقارنة مواقع نقاط التحكم المتطابقة بين صور ما قبل الإجهاد وصور الإجهاد الكامل.

تتم أيضًا مقارنة المواضع من أجل الانفعال المتبقي بين صور ما قبل التدريب وصور ما بعد الانفعال. وتُستخدم نقاط التحكم في آن واحد لتسجيل أزواج الصور، مما يساعد في الكشف عن الخلايا التالفة أو المنفصلة. بعد ذلك، يتم تحديد النوى يدويًا باستخدام برنامج MATLAB منفصل يقوم بحساب الانفعال النووي لكل نواة على حدة.

يتم تحقيق ذلك من خلال مطابقة حجم النواة بين الصور الفلورية المقابلة قبل الإجهاد الكامل وبعده، أو عن طريق مطابقة العلامات داخل النواة لمراعاة الاختلافات الطفيفة في إجهاد الغشاء المطبق بين التجارب المختلفة. وتُعبر النتائج عن إجهاد النواة المعياري، والذي يُعرف بأنه نسبة إجهاد النواة المستحث إلى إجهاد الغشاء المطبق المحسوب لكل نواة.

تتوفر سكربتات MATLAB من مختبر lambing بناءً على الطلب. وكخطوة نهائية، يتم التحقق من صحة كل نواة، وتُستبعد القياسات المأخوذة من الخلايا التي تنفصل أو تتضرر أثناء تطبيق الإجهاد. تم تصوير الخلايا الليفية الجنينية MEFs المنتشرة عبر منطقتين متميزتين على غشاء السيليكون باستخدام مجهر تباين الطور والمجهر الفلوري قبل وأثناء وبعد تطبيق إجهاد محوري بنسبة 20%UNI؛ الموضح هنا هو مثال لتجربة ناجحة بنوى صالحة من خلايا صمدت أمام تطبيق الإجهاد دون حدوث أي ضرر أو انفصال.

في المقابل، تظهر الخلايا الموضحة هنا وهي تنكمش أو تنفصل جزئياً أثناء تطبيق الإجهاد، لذا فهي مستبعدة من التحليل. تُظهر الخلية الموجودة على الجانب الأيسر علامات على تلف الهيكل الخلوي وانهيار النواة، بينما تنفصل الخلية الموجودة على الجانب الأيمن جزئياً وتنكمش أثناء تطبيق الإجهاد. يمكن أن يكون هذا مؤشراً على تعرض الخلايا لإجهاد مفرط.

يظهر هنا تحليل للإجهاد النووي المُطبع في مجموعة من خطوط خلاياmeth مختلفة لفئران تعاني من نقص في Lamin AC، حيث تعبر الخلايا بشكل خارجي إما عن ناقل فارغ أو عن Lamin A من النوع البري مقارنة بخلاياmeth من أشقاء من النوع البري؛ حيث يؤدي فقدان التعبير عن بروتينات الغلاف النووي Lamin AC إلى زيادة الإجهاد النووي المُطبع. يشير هذا إلى انخفاض صلابة النواة، والتي يمكن استعادتها جزئياً أو كلياً عن طريق إعادة إدخال Lamin A من النوع البري. للتحضير لتجربة المناولة بالإبر المجهرية، يتم تحضين طبق زراعة خلايا بقاع زجاجي مقاس 35 مليمتر مع تركيز منخفض من fibronectin لمدة ساعتين عند 37 °C، وبعد التحضين، يُغسل الطبق مرتين باستخدام HBSS ويُضاف إليه 2 mL من وسط النمو.

بعد ذلك، يتم تريبسين الخلايا الليفية الجنينية للفئران باستخدام تريبسين بتركيز 0.05%، ثم تُزرع في وسط نمو على أطباق ذات قاع زجاجي مطلية بالفيبرونيكتين في 2 mL من وسط النمو. وللحصول على خلايا ملتصقة فردية غير متلاحمة، تُوضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة طوال الليل؛ وصبغ الخلايا، يُضاف صبغ MitoTracker للميتوكوندريا وصبغ Hoechst للنواة إلى وسط النمو. يُضاف وسط النمو هذا إلى الخلايا ثم تُتبع بعملية التحضين.

بعد ذلك، اغسل الخلايا عن طريق تحضينها في محلول ملحي منظم هانك (hank's buffered salt saline) لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف وسط نمو خالٍ من الفينول الأحمر مع 25 millimolar من He piece إلى الخلايا من أجل التصوير.

بالنسبة لتجربة الإبر الدقيقة، أدخل إبرة دقيقة تم سحبها مسبقاً في جهاز تحريك دقيق متصل بمجهر مقلوب مزود بجهاز اقتران شحني رقمي (CCD). قم بتوجيه الكاميرا وضبط بؤرة الإبرة الدقيقة بالقرب من خلية واحدة. التقط صورة واحدة للخلية المنفردة قبل إدخال الإبرة الدقيقة في الهيكل الخلوي.

في وضع تباين الطور، يتم التقاط صورة فلورية واحدة لصبغة hooks 3 3, 3 4 2 وصورة فلورية واحدة لصبغة الميتوكوندريا باستخدام عدسة شيئية 60 x على مجهر مقلوب. وباستخدام الميكرو-مانيبوليتور، يتم إدخال الإبرة الدقيقة بعناية في سيتوبلازم الخلية على مسافة ثابتة بعيداً عن المحيط النووي، ثم يتم التقاط صورة واحدة بتباين الطور، وصورة فلورية واحدة لصبغة hooks 3 3, 3 4, 2، وصورة فلورية واحدة لصبغة الميتوكوندريا. يتم تحريك الإبرة الدقيقة مسافة محددة باتجاه محيط الخلية بسرعة 1 ميكرومتر في الثانية، باستخدام الميكرو-مانيبوليتور المتحكم به حاسوبياً مع الحصول على الصور تلقائياً كل 10 ثوانٍ.

بينما تتحرك الإبرة المجهرية لمسافة محددة باتجاه محيط الخلية، يجب التحكم في المجهر المناور (micro manipulator) عبر جهاز كمبيوتر لتحقيق مناورة مجهرية متسقة. وفي الختام، يتم التقاط الصور بعد إزالة الإبرة المجهرية؛ حيث يتم تحليل صور الهيكل الخلوي والميزات المصبوغة فلورسنتياً للنواة والهيكل الخلوي، والتي تم الحصول عليها قبل وأثناء وبعد المناولة بالإبرة المجهرية، لحساب إزاحة المناطق الصغيرة داخل الخلايا. وفي هذا العرض التوضيحي، يُستخدم نص برمجى (script) مكتوب خصيصاً بلغة MATLAB للتحليل، ولكن تتوفر عدة خيارات أخرى.

يمكن الحصول على نص MATLAB البرمجي من مختبر lambing عند الطلب لقياس الإزاحة الناتجة عن الإبرة المجهرية. يستخدم برنامج MATLAB خوارزمية الارتباط المتقاطع المعياري لحساب الإزاحة بين الموقع الأصلي للمعالم الملحقة بصبغة فلورية وموقعها المحدد حديثاً. ثم يتم عرض هذه الإزاحات كخرائط شعاعية وتخزينها كقيم عددية.

تتمثل الخطوة التالية في استخدام خرائط ناقل الإزاحة الناتجة لتحديد متوسط الإزاحات داخل الهيكل الخلوي أو النواة باستخدام برنامج matlab. أولاً، قم باختيار ثلاث نقاط أو أكثر داخل الهيكل الخلوي عند موقع تطبيق الإجهاد. وفي خريطة ناقل الإزاحة، خذ القيمة العددية المتوسطة لتحديد مقدار إجهاد الهيكل الخلوي بالقرب من موقع التطبيق والذي نتج أثناء تطبيق الإبرة المجهرية.

بعد ذلك، اختر ثلاث نقاط أو أكثر داخل النواة بالقرب من موقع تطبيق الإجهاد واحسب القيمة المتوسطة. تمثل هذه القيمة مقدار الإجهاد النووي بالقرب من موقع تطبيق الإبرة الدقيقة. وباستخدام الطريقة نفسها، حدد الإجهاد النووي وإجهاد الهيكل الخلوي بعيدًا عن موقع تطبيق الإجهاد من خلال نقاط مختارة في هذه المناطق المحددة.

أُجري اختبار مناولة بالإبر الدقيقة لقياس انتقال القوة داخل الخلايا. تظهر هنا صور تباين الطور وصور فلورية لخلية ليفية (fibroblast) مُعلمة بصبغة نووية زرقاء وصبغة MIT tracker green للميتوكوندريا. تم إدخال إبرة دقيقة في الهيكل الخلوي على مسافة محددة من النواة، ثم حُركت لاحقاً باتجاه محيط الخلية.

تم تتبع إزاحة الميتوكوندريا قبل وأثناء وبعد إجهاد الهيكل الخلوي، ثم رُسمت الإزاحات على شكل متجهات. يمثل كل متجه الإزاحة التي حُسبت كفرق بين الموقع الأصلي والموقع المحدد حديثاً. استُبعدت من التحليل المناطق ذات الكثافة الصورية المنخفضة أو التي تفتقر إلى النسيج الكافي.

ثم تم قياس الإزاحة الهيكلية الخلوية والنووية كمياً في مناطق مختارة على مسافات متزايدة من موقع تطبيق الإجهاد لكل من الخلايا الليفية الضابطة والخلايا الليفية. في الخلايا ذات الاقتران السليم بين النواة والهيكل الخلوي، تُنقل القوى عبر الخلية بأكملها، مما يؤدي إلى تشوه نووي وهيكلي مستحث يتلاشى ببطء بعيداً عن موقع تطبيق الإجهاد. في المقابل، تظهر الخلايا ذات الاقتران المختل بين النواة والهيكل الخلوي إزاحة موضعية بالقرب من موقع التطبيق، مع تشوه مستحث طفيف فقط في المناطق الأبعد.

يُلاحظ تطبيق إجهاد مماثل للهيكل الخلوي في موقع إدخال الإبرة الدقيقة لكل من الخلايا الليفية الضابطة والخلايا الليفية ذات الاقتران النووي الهيكلي المختل. ومع ذلك، كان الإزاحة النووية والهيكلية المستحثة في المناطق الأخرى أصغر بشكل ملحوظ في الخلايا الليفية ذات الاقتران النووي الهيكلي المختل مقارنة بالخلايا الضابطة. وبالتالي، فإن انخفاض الإزاحة الهيكلية والنووية بعيداً عن موقع تطبيق الإجهاد يشير إلى أن النقل القسري بين الهيكل الخلوي والنواة قد تعطل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الميكانيكا النووية ونقل القوى داخل الخلايا بين النواة والهيكل الخلوي. يمكنك استخدام هذه التقنيات لدراسة تأثير الطفرات في بروتينات الغلاف النووي أو التغيرات في تكوين الغلاف النووي التي تحدث أثناء التطور أو في السرطان.