البيوفيزيائية فحوصات للتحقيق في الخواص الميكانيكية للنواة الخلية الطور البيني : الركيزة التطبيق الانفعال والتلاعب Microneedle

الهدف العام من التجارب التالية هو قياس الخصائص الميكانيكية لنواة الخلية واتصالها الفيزيائي بالهيكل الخلوي المحيط بها. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تسليط إجهاد ميكانيكي على خلايا مزروعة على غشاء سيليكون شفاف وتصوير التشوهات النووية الناتجة. وتتوافق زيادة التشوهات النووية مع انخفاض صلابة النواة، بما أن التغيرات في الاقتران بين النواة والهيكل الخلوي يمكن أن تؤثر أيضاً على التشوهات النووية المستحثة.

يتم سبر انتقال القوى داخل الخلايا بين الهيكل الخلوي والنواة بشكل مباشر من خلال تطبيق إجهاد موضعي على الهيكل الخلوي. ثم يتم تصوير إزاحة التراكيب النووية والهيكلية الخلوية الموسومة فلوريسينياً في NU. وتُستخلص النتائج التي توضح صلابة نوى الخلايا بالنسبة للهيكل الخلوي المحيط بها.

بناءً على تجارب سلالة الركيزة، يكشف مقايسة المناولة بالإبر الدقيقة أن تعطيل الاقتران بين النواة والهيكل الخلوي يسبب عيوباً في نقل القوة داخل الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنيات مقارنة بالطرق الحالية، مثل شفط الماصة الدقيقة للنوى المعزولة، في أنها تتيح قياس ميكانيكا النواة في خلايا حية سليمة دون تعطيل البنية الخلوية الطبيعية. ويمكن لهذه الطرق أن تقدم رؤية حول كيفية تأثير التغيرات في تكوين الغلاف النووي على الخصائص الميكانيكية للنواة.

ويمكن تطبيقها أيضاً لدراسة دور الميكانيكا النووية في سياق أمراض مثل اعتلالات الأعصاب المرتبطة بـ LA أو السرطان. يتكون كل طبق إجهاد من طبق بلاستيكي مخصص بدون قاع بقطر ثلاثة بوصات وحلقة بلاستيكية تثبت غشاءً من السيليكون، والذي يعمل كركيزة لزراعة الخلايا. ولتحضير طبق الإجهاد، قم بتثبيت قطعة من غشاء السيليكون بمقاس أربع بوصات في أربع بوصات بين الحلقة والطبق، ثم قص الغشاء الزائد بعناية، واشطف طبق الإجهاد بالماء منزوع الأيونات، ثم قم بتعقيم الطبق بالـ autoclave قبل طلاء غشاء السيليكون بجزيئات المصفوفة خارج الخلوية، ثم حدد نقطة مرجعية على الجزء الخارجي من الغشاء في المركز السفلي.

ستساعد هذه العلامة المرجعية في التعرف على الخلايا ذاتها أثناء تجارب الإجهاد عند تطبيق الإجهاد أحادي المحور. يتم وضع شريطين متوازيين من الشريط اللاصق حول النقطة المرجعية لتقييد تكوين الغشاء في بُعد واحد. ولضمان التصاق الخلايا بشكل مثالي، يتم طلاء أغشية السيليكون بـ 3 µg/mL من الفبرونيكتين أو أي من بروتينات المصفوفة خارج الخلوية المناسبة.

غَطِّ طبق الترشيح بطبق بوليسترين مقلوب مقاس 10 سنتيمتر واتركه في الحاضنة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في اليوم التالي. اشطف الغشاء مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة البروتين الزائد. املأ الطبق بـ 10 milliliters من وسط النمو واتركه جانباً.

بمجرد تحضير طبق غشاء السيليكون المطلي، يتم فصل الخلايا باستخدام trypsin بتركيز 0.05%، ثم تُزرع الخلايا الملتصقة في الطبق باستخدام وسط نمو. يتم توضيح هذا الإجراء باستخدام خلايا جنينية للفأر.

يتم تحضين الخلايا الليفية أو الخلايا الميزنكيمية لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة تحت ظروف زراعة عادية. يتكون المجهر المقلوب المجهز لتجارب إجهاد الركيزة من جهاز إجهاد يشتمل على صفيحة قاعدة تثبت على منصة المجهر. وتحمل هذه الصفيحة قرصاً أسطوانياً مركزياً من البلاتين، والذي يعمل على تسليط الإجهاد على القسم المركزي من غشاء السيليكون.

يحتوي الجهاز أيضاً على صفيحة متحركة تحمل طبق الإجهاد ويمكنها الانزلاق للأعلى والأسفل على أربعة دبابيس توجيه، بالإضافة إلى وزن قدره خمسة أرطال لتطبيق الحمل. ومن أجل تصور النوى، يتم تحضين الخلايا في طبق الإجهاد مع واحد ميكروجرام لكل مليلتر من صبغة هوكست لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وبعد التحضين، يتم سحب الوسط واستبداله بـ 15 مليلتر من وسط نمو خالٍ من الفينول الأحمر مع 25 مليمولار من heis.

بعد ذلك، قم بربط الطبق في حامل الأطباق، وضع الشحم بعناية على محيط الجزء السفلي من الغشاء السيليكوني لضمان انزلاق الغشاء على طول لوح البلاتين المركزي. تأكد من إبقاء الجزء المركزي من الغشاء نظيفاً. ضع اللوحة القاعدية على لوحة منصة المجهر، ثم قم بتركيب حامل الأطباق بعناية على اللوحة القاعدية.

تأكد من أن الغشاء السيليكوني لطبق الإجهاد يستقر بشكل فضفاض على البلاتين المركزي في وضع السكون الأولي. بعد ذلك، ركز على الجزء السفلي من الغشاء السيليكوني وابحث عن نقطة المرجع السوداء المركزية. ستكون هذه النقطة بمثابة نقطة البداية لجميع عمليات التقاط الصور وتساعد في تحديد موقع الخلايا نفسها أثناء وبعد عملية التمدد.

في هذه الصورة، تملأ النقطة المركزية كامل مجال الرؤية. ابدأ من حدود النقطة، ثم اضبط التركيز لرؤية الخلايا والجزء العلوي من غشاء السيليكون. حدد الخلايا المفرودة جيداً والتي تقع نوياتها في المركز.

قم بالتقاط صورة تباين الوجه (face contrast)، والتي يجب أن تركز على المخطط الخارجي للخلية والغشاء السيليكوني. بعد ذلك، التقط صورة فلورية لصبغة الخطاف النووي (nuclear hook stain)، والتي يجب أن تركز على المستوى المركزي للنواة. بعد التقاط صور لخمس إلى 15 خلية، عد إلى النقطة المركزية.

ضع الثقل ببطء على طبق الإجهاد لضمان تطبيق إجهاد منتظم في مركز الطبق. ويتم تحديد الحد الأقصى لإجهاد الركيزة المطبق بواسطة فواصل نايلون موضوعة على دبابيس المحاذاة الرأسية؛ بعد تطبيق الإجهاد، ركز على الجزء السفلي من غشاء السيليكون وحدد النقطة المرجعية مرة أخرى، بدءًا من تلك النقطة.

أعد تحديد موقع الخلايا نفسها، والتقط مجدداً صورة تباين طورية وصورة فلورية نهائية لكل خلية في النواة تحت إجهاد كامل، مع محاولة مطابقة المستويات البؤرية للصور الأولية بدقة. يجب ألا تتجاوز هذه العملية 10 دقائق لتجنب إعادة التشكيل النشط وتكيف الخلية مع الركيزة الغريبة. بعد الحصول على جميع الصور المقابلة، أعد منصة المجهر إلى نقطة البداية.

قم بإزالة الثقل بعناية من لوحة حامل الطبق واترك الغشاء السيليكوني ليرتخي إذا لزم الأمر. ادفع طبق الترشيح للأعلى برفق حتى يصل إلى الموضع الأولي. بعد ذلك، قم بالحصول على صور تباين الطور والفلورة.

يتم تحليل صور الخلايا بعد تطبيق الإجهاد، تماماً كما هو موضح في صور الإجهاد، وصور الخلايا والنوى المحددة بصبغة فلورية قبل وأثناء وبعد تطبيق الإجهاد، وذلك لحساب الإجهاد النووي الموحد. في هذا العرض التوضيحي، يتم استخدام نص برمجي مخصص مكتوب بلغة MATLAB لإجراء التحليل، ولكن تتوفر عدة خيارات بديلة لحساب إجهاد الركيزة المطبق يدوياً من خلال مطابقة مواقع ثلاث إلى ست نقاط تحكم تقع على الغشاء بين الصور المقابلة قبل الإجهاد وبعد الإجهاد الكامل. بعد ذلك، يقوم برنامج MATLAB بحساب إجهاد الغشاء المطبق عن طريق مقارنة مواقع نقاط التحكم المتطابقة بين صور ما قبل الإجهاد وصور الإجهاد الكامل.

تتم أيضاً مقارنة المواقع لتقدير الانفعال المتبقي بين صور ما قبل التدريب وصور ما بعد الانفعال. تُستخدم نقاط التحكم في آن واحد لمطابقة أزواج الصور، مما يساعد في الكشف عن الخلايا التالفة أو المنفصلة. بعد ذلك، يتم تحديد النوى يدوياً باستخدام برنامج MATLAB منفصل يقوم بحساب الانفعال النووي لكل نواة على حدة.

يتم تحقيق ذلك من خلال مطابقة حجم النواة بين الصور الفلورية المتقابلة قبل الإجهاد الكامل وبعده، أو عن طريق مطابقة العلامات داخل النواة لتعويض الاختلافات الطفيفة في إجهاد الغشاء المطبق بين التجارب المختلفة. ويتم التعبير عن النتائج كإجهاد نووي مُطبع، والذي يُعرف بأنه نسبة الإجهاد النووي المستحث إلى إجهاد الغشاء المطبق المحسوب لكل نواة.

تتوفر نصوص MATLAB البرمجية من مختبر lambing عند الطلب. وكخطوة نهائية، يتم التحقق من صحة كل نواة، وتُستبعد القياسات المأخوذة من الخلايا التي تنفصل أو تتعرض للتلف أثناء تطبيق الإجهاد. تم تصوير خلايا MEFs المنتشرة عبر منطقتين متمايزتين على غشاء السيليكون باستخدام مجهر تباين الطور والمجهر الفلوري قبل وأثناء وبعد تطبيق إجهاد محوري بنسبة 20%UNI؛ ويظهر هنا مثال لتجربة ناجحة تحتوي على نوى صالحة من خلايا نجت من تطبيق الإجهاد دون أي تلف أو انفصال.

في المقابل، أصبحت الخلايا الموضحة هنا منكمشة أو منفصلة جزئياً أثناء تطبيق الإجهاد، لذا استُبعدت من التحليل. تُظهر الخلية الموجودة على الجانب الأيسر علامات تلف في الهيكل الخلوي وانهيار نووي، بينما تنفصل الخلية الموجودة على الجانب الأيمن جزئياً وتنكمش أثناء تطبيق الإجهاد. ويمكن أن يكون هذا مؤشراً على الإجهاد المفرط.

يظهر هنا تحليل للانفعال النووي المعياري في مجموعة من الخطوط الخلوية المختلفة لخلايا الميث (meth) المستمدة من فئران تعاني من نقص في البروتين Lamin AC، حيث تعبر هذه الخلايا بشكل خارجي إما عن ناقل فارغ أو عن البروتين Lamin A من النوع البري، وذلك بالمقارنة مع خلايا الميث من أشقاء من النوع البري. يؤدي فقدان التعبير عن بروتينات الغلاف النووي Lamin AC إلى زيادة في الانفعال النووي المعياري، وهو ما يشير إلى انخفاض صلابة النواة، والتي يمكن استعادتها جزئياً أو كلياً عن طريق إعادة إدخال Lamin A من النوع البري. وللتحضير لتجربة التلاعب بالإبر المجهرية، يتم تحضين طبق زراعة خلوية ذو قاعدة زجاجية بقطر 35 مليمتر بتركيز منخفض من الفيبرونكتين (fibronectin) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية، وبعد التحضين، يُغسل الطبق مرتين باستخدام محلول HBSS ثم يُضاف إلى الطبق 2 مل من وسط النمو.

بعد ذلك، يتم معالجة الخلايا الليفية الجنينية للفئران بإنزيم التريبسين بتركيز 0.05%، ثم تُزرع في وسط نمو على أطباق ذات قاع زجاجي مغطاة بالفايبرونكتين في 2 mL من وسط النمو. وللحصول على خلايا غير متلاصقة وملتصقة ومنفردة، تُوضع الخلايا مجدداً في الحاضنة طوال الليل؛ ولصبغ الخلايا، يُضاف صبغ الميتوكوندريا Mitotracker وصبغ النواة Hoechst إلى وسط النمو. يُضاف وسط النمو هذا إلى الخلايا ثم تُحضن.

بعد ذلك، اغسل الخلايا عن طريق تحضينها في محلول هانكس الملح الموّزن (hank's buffered salt saline) لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف إلى الخلايا وسط نمو خالٍ من الفينول الأحمر يحتوي على 25 millimolar من HEPES من أجل التصوير.

بالنسبة لتجربة الإبر الدقيقة، قم بتركيب إبرة دقيقة مسحوبة مسبقاً في جهاز تلاعب دقيق (micro manipulator) متصل بمجهر مقلوب مزود بجهاز اقتران شحني رقمي (digital charge coupled device). استخدم الكاميرا لضبط بؤرة الإبرة الدقيقة بالقرب من خلية واحدة. ثم التقط صورة واحدة للخلية المنفردة قبل إدخال الإبرة الدقيقة في الهيكل الخلوي.

في تباين المرحلة، يتم التقاط صورة فلورية واحدة لصبغة hooks 3 3, 3 4 2 وصورة فلورية واحدة لصبغة الميتوكوندريا باستخدام عدسة شيئية 60 x على مجهر مقلوب؛ وباستخدام الملاعب الدقيق، يتم إدخال الإبرة الدقيقة بعناية في سيتوبلازم الخلية على مسافة ثابتة بعيداً عن المحيط النووي، ثم يتم التقاط صورة واحدة بتباين المرحلة، وصورة فلورية واحدة لصبغة hooks 3 3, 3 4, 2، وصورة فلورية واحدة لصبغة الميتوكوندريا. يتم تحريك الإبرة الدقيقة مسافة محددة نحو محيط الخلية بسرعة 1 µm/s، باستخدام الملاعب الدقيق الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر مع التقاط الصور تلقائياً كل 10 s.

بينما تتحرك الإبرة الدقيقة لمسافة محددة باتجاه محيط الخلية، يجب التحكم في الملاعب الدقيق (micro manipulator) عبر جهاز كمبيوتر لتحقيق تلاعب دقيق متسق. وفي نهاية الإجراءات، يتم التقاط الصور بعد إزالة الإبرة الدقيقة؛ حيث تُحلل صور الهيكل الخلوي للميزات الموصومة فلورياً للنواة والهيكل الخلوي، والتي تم التقاطها قبل وأثناء وبعد التلاعب بالإبرة الدقيقة، لحساب إزاحة المناطق الصغيرة داخل الخلية. في هذا العرض التوضيحي، يتم استخدام نص برمجى (script) مكتوب خصيصاً بلغة MATLAB للتحليل، ولكن تتوفر عدة خيارات أخرى.

يتوفر نص MATLAB البرمجي من مختبر lambing عند الطلب لقياس الإزاحة الناتجة عن الإبرة المجهرية. يستخدم برنامج MATLAB خوارزمية الارتباط المتقاطع الموحد لحساب الإزاحة بين الموقع الأصلي للميزات المسمى فلورياً وموقعها الذي تم تحديده حديثاً. ثم يتم عرض الإزاحات على شكل خرائط متجهية وتخزينها كقيم عددية.

تتمثل الخطوة التالية في استخدام خرائط ناقل الإزاحة الناتجة لتحديد متوسط الإزاحات داخل الهيكل الخلوي أو النواة باستخدام برنامج matlab. أولاً، اختر ثلاث نقاط أو أكثر داخل الهيكل الخلوي عند موقع تطبيق الإجهاد. في خريطة ناقل الإزاحة، خذ القيمة العددية المتوسطة لتحديد مقدار إجهاد الهيكل الخلوي بالقرب من موقع التطبيق الذي تولد أثناء تطبيق الإبر المجهرية.

بعد ذلك، حدد ثلاث نقاط أو أكثر داخل النواة بالقرب من موقع تسليط الإجهاد واحسب القيمة المتوسطة. تمثل هذه القيمة مقدار الإجهاد النووي بالقرب من موقع تطبيق الإبرة الدقيقة. وباستخدام الطريقة نفسها، حدد الإجهاد النووي وإجهاد الهيكل الخلوي بعيداً عن موقع تسليط الإجهاد من خلال نقاط مختارة في هاتين المنطقتين على التوالي.

أُجري اختبار تلاعب بالإبر الدقيقة لقياس نقل القوة داخل الخلايا. تظهر هنا صور تباين الطور وصور فلورية لخلية أرومية ليفية مصبوغة بصبغة نووية زرقاء وصبغة MIT tracker green للميتوكوندريا. تم إدخال إبرة دقيقة في الهيكل الخلوي على مسافة محددة من النواة، ثم حُرِّكت لاحقاً باتجاه محيط الخلية.

تتبع إزاحة الميتوكوندريا قبل وأثناء وبعد إجهاد الهيكل الخلوي، ثم رُسمت الإزاحات على شكل متجهات. يمثل كل متجه الإزاحة المحسوبة كفرق بين الموقع الأصلي والموضع المحدد حديثاً. استُبعدت المناطق ذات الكثافة الضوئية المنخفضة في الصورة أو التي تفتقر إلى القوام الكافي من التحليل.

بعد ذلك، تم قياس الإزاحة الهيكلية الخلوية والنووية كمياً في مناطق مختارة على مسافات متزايدة من موقع تطبيق الإجهاد لكل من الخلايا الليفية الضابطة والخلايا الليفية. وفي الخلايا ذات الاقتران السليم بين النواة والهيكل الخلوي، تنتقل القوى عبر الخلية بأكملها، مما يؤدي إلى تشوه نووي وهيكلي مستحث يتلاشى تدريجياً كلما ابتعدنا عن موقع تطبيق الإجهاد. وفي المقابل، تظهر الخلايا ذات الاقتران المختل بين النواة والهيكل الخلوي إزاحة موضعية بالقرب من موقع التطبيق، مع حدوث تشوه مستحث طفيف فقط في المناطق البعيدة.

لوحظ تطبيق إجهاد هيكلي خلوي مماثل في موقع إدخال الإبر الدقيقة لكل من الخلايا الليفية الضابطة والخلايا الليفية ذات الاقتران النووي الهيكلي الخلوي المقطوع. ومع ذلك، كانت الإزاحة النووية والهيكلية الخلوية المستحثة في المناطق الأخرى أصغر بشكل ملحوظ في الخلايا الليفية ذات الاقتران النووي الهيكلي الخلوي المقطوع مقارنة بالخلايا الضابطة. وبناءً على ذلك، فإن انخفاض الإزاحة الهيكلية والنووية بعيدًا عن موقع تطبيق الإجهاد يشير إلى أن النقل القسري بين الهيكل الخلوي والنواة قد تعطل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الميكانيكا النووية ونقل القوة داخل الخلايا بين النواة والهيكل الخلوي. يمكنك استخدام هذه التقنيات لدراسة تأثير الطفرات في بروتينات الغلاف النووي أو التغيرات في تكوين الغلاف النووي التي تحدث أثناء النمو أو في حالات السرطان.