$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ابدأ بالخلايا الظهارية الثابتة والمتنفذة المصابة بطفيلي ممرض
أضف حاجزا مؤقتا لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
تراكب مع الأجسام المضادة الأولية متعددة النسيلة للفأر ، تتفاعل على وجه التحديد مع بروتينات الطفيلي.
أضف الأجسام المضادة الثانوية ذات اللون الأحمر البعيد المسمى بالفلوروفور والتي تتفاعل مع الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالبروتين الطفيلي.
يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. كتلة الأجسام المضادة للفئران التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية ، مما يقلل من التفاعل المتبادل أثناء وضع العلامات على البروتين المضيف.
أضف الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة للفأر التي تستهدف البروتينات النووية الريبية المضيفة داخل الخلايا الظهارية.
تراكب بمزيج من الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروفور الأخضر والفالودين المترافق بالفلوروفور الأحمر ، مما يسهل وضع العلامات على الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالبروتين المضيف والأكتين ، على التوالي.
يغسل بمخزن مؤقت. قم بالتركيب باستخدام وسيط يحتوي على صبغة الحمض النووي ، مما يضفي لونا أزرق على النواة المضيفة ونواة الطفيليات والحركية.
تحليل العينات باستخدام مجهر متحد البؤر. تظهر تقنية التألق المناعي مزدوج العلامات بروتينات المضيف الخضراء والبروتينات الطفيلية الحمراء ، مما يتيح توطينها الدقيق تحت الخلايا.
أضف خلايا LLC-MK2 في ألواح ذات 24 بئرا تحتوي على أغطية مستديرة معقمة بالأشعة فوق البنفسجية واتركها تستقر لمدة 16 ساعة. ثم لإصابة الخلايا ، أضف المادة المطفية التي تحتوي على T. cruzi إلى كل بئر ، واحتضانها لمدة ست ساعات. بعد ذلك ، اغسل أغطية تحتوي على الخلايا المصابة وغير المصابة 5 مرات باستخدام PBS.
ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 2٪ بارافورمالدهيد و PBS. بعد 10 دقائق ، اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام PBS ، ثم تخلل الأغطية بمنظف غير أيوني لمدة 10 دقائق.
بعد ثلاث غسلات PBS لمدة 5 دقائق ، احتضن الأغطية في محلول مانع لمدة 30 دقيقة ، متبوعا بحضانة أخرى لمدة 30 دقيقة إما بجسم مضاد أحادي النسيلة أو متعدد النسيلة. بعد الغسيل ، احتضان الغطاء لمدة 30 دقيقة بجسم مضاد ثانوي في محلول مانع والفالودين لتلطيخ خيوط الأكتين في الخلية المضيفة.
بعد ذلك ، اغسل الغطاء باستخدام PBS ثلاث مرات مرة أخرى قبل وضع كمية صغيرة من كاشف التثبيت المضاد للبهتان مع وسيط DAPI على سطح الشريحة. باستخدام الملقط ، قم بإمالة الغطاء برفق في الوسط لمنع تكون الفقاعة.
لوضع العلامات المزدوجة ، بعد احتضان الغطاء ومحلول الحجب كما هو موضح سابقا ، قم باحتضانها في الجسم المضاد متعدد النسيلة للفأر لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الغطاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام PBS قبل احتضانها بالجسم المضاد الثانوي لمدة 30 دقيقة.
ثم بعد ثلاث غسلات PBS ، قم بإجراء خطوة حظر ثانية باستخدام IgG المضاد للفأر AffiniPure المخفف في محلول الحظر. بعد 30 دقيقة ، اغسل الغطاء باستخدام PBS مرة أخرى قبل احتضانه بالجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر لمدة 30 دقيقة أخرى.
بعد ذلك ، بعد ثلاث غسلات PBS ، احتضن الأغطية بجسم مضاد IgG2b مضاد للفأر وفالويدين. بعد ذلك ، بعد ثلاث غسلات PBS ، قم بتطبيق كاشف تثبيت مضاد للبهتان كما هو موضح سابقا.