تقنية تلطيخ التألق المناعي للكشف عن تكوين الخلايا العصبية في الحصين لدى البالغين

خذ قسما لدماغ الفئران يتكون من التلفيف المسنن في الحصين ، وهو موقع لتكوين الخلايا العصبية يتكون من أسلاف عصبية في مراحل تمايز متميزة.

انقل القسم إلى محلول حجب النفاذية. تتخلل جزيئات المنظفات الموجودة في المحلول الخلايا ، بينما تمنع البروتينات مواقع الارتباط غير المحددة.

أضف كوكتيلا أساسيا للأجسام المضادة يستهدف علامات تكوين الخلايا العصبية المحددة ، وبروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة ، وبروتين خيوط وسيطة.

قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. إدخال أجسام مضادة ثانوية مختلفة تحمل علامة الفلوروفور مرتبطة بالأجسام المضادة الأولية.

أضف بروتينات المصل من نفس المضيف مثل أحد الأجسام المضادة الأساسية ، مما يؤدي إلى تشبع الباراتوبات على الأجسام المضادة الثانوية.

أدخل شظايا Fab أحادية التكافؤ التي تشبع حواتم بروتينات المصل ، مما يمنع الارتباط غير المحدد.

أضف جسما مضادا أساسيا ثانيا مرفوعا من نفس المضيف ، يرتبط ببروتين خيوط وسيط آخر.

إدخال الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروفور التي تستهدف الجسم المضاد الأولي الثاني.

باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، حدد الأنواع الفرعية للسلف العصبي التي تعبر عن مجموعات علامات فريدة.

ابدأ بنقل الأقسام من محلول التجمد إلى TBS بمساعدة فرشاة دقيقة. اشطف الأقسام جيدا ، بدءا من الغسيل طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، متبوعا بخمس غسلات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يجب إجراء كل هذه الحضانات مع التحريض اللطيف المستمر.

إذا كان أحد المستضدات ذات الأهمية هو نظير الثايميدين ، فيجب تنفيذ خطوة تمسخ حمض الهيدروكلوريك في هذه المرحلة ، متبوعة بخطوة تحييد في المخزن المؤقت للبورات. المضي قدما في نفاذية وحظر مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة في TBS-plus. دع هذه الحضانة تذهب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، احتضن أول جسم مضاد أولي مخفف في TBS-plus بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الأقسام ثلاث مرات في TBS ، ومرة واحدة في TBS-T. دع كل حمام لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، احتضن في أول جسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروكروم لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. من الآن فصاعدا ، قم بحماية الأقسام من التعرض للضوء.

بعد سلسلة غسيل أخرى ، انقل الأقسام إلى محلول مصل من الأنواع المضيفة بنسبة 10٪ تم من خلاله صنع الجسمان المضادان الأساسيان. احتضان الأقسام في هذا المحلول لمدة ثلاث ساعات لتشبع الباراتوبات المفتوحة على الجسم المضاد الثانوي الأول. في وقت لاحق ، اشطفه ثلاث مرات في TBS ، ومرة واحدة في TBS-T لإزالة المصل.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول TBS-plus مع 50 ميكروغراما لكل مليلتر من شظايا Fab أحادية التكافؤ غير المترافقة الموجهة ضد الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي. يغطي هذا الحلقات التي يمكن التعرف عليها بواسطة الجسم المضاد الثانوي الثاني. انقل الأقسام إلى هذا المحلول واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

بعد الحضانة ، اشطف الأقسام ثلاث مرات على الأقل في TBS ، ومرة واحدة في TBS-T. أثناء عمليات النقل ، قم بمسح الحشوات الشبكية التي تحتوي على الأقسام الموجودة على منشفة ورقية لإزالة الخروج المتبقي من Fab. الآن ، احتضان الأقسام في الجسم المضاد الأساسي الثاني بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.

بعد سلسلة غسيل أخرى ، ضع الجسم المضاد الثانوي الثاني لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، اغسل الأقسام ثلاث مرات في TBS واستمر في تركيب الأقسام بالجيلاتين. جفف الشرائح بالهواء وقم بتغطيتها باستخدام وسيط تثبيت مضاد للبهتان.