تقنية تلطيخ الأعضاء بالكامل للتصوير ثلاثي الأبعاد للكلى

خذ كلية فأر ثابتة. تسبب الدهون في الأنسجة تشتت الضوء ، وتسبب الأصباغ امتصاص الضوء ، مما يجعل الخلايا معتمة.

عالج الأنسجة باستخدام CUBIC-L لإزالة الدهون وإزالة اللون. يزيل الكحول الأميني الموجود في CUBIC-L الدهون والأصباغ ، مما يقلل من تشتت الضوء ويزيد من الشفافية.

تتخلل جزيئات المنظفات في CUBIC-L الخلايا أيضا.

إدخال كوكتيل الأجسام المضادة الأولية التي ترتبط بهيدروكسيلاز التيروزين السيتوبلازمي في الخلايا العصبية للأعصاب السمبثاوية وأكتين العضلات الملساء ألفا في خلايا العضلات الملساء للأوعية.

أضف الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروفور والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

قم بإجراء تثبيت الأنسجة للحفاظ على علاج الأجسام المضادة.

اغمر الأنسجة في CUBIC-R + الذي يحل محل الماء ويطابق معامل الانكسار للبروتينات ، مما يقلل من تشتت الضوء ويزيد من الشفافية.

تحت المجهر الفلوري الخفيف ، تضيء الألواح الضوئية الأنسجة ، مما يثير الفلوروفورات.

التقط الضوء المنبعث من الفلوروفور وأعد بناء صورة ثلاثية الأبعاد، مع عرض توزيع الأعصاب الودي حول الشرايين في الكلى.

للبدء ، قم بإجراء تثبيت الغمر مباشرة بعد تثبيت التروية وأخذ عينات الكلى عن طريق غمر الكلى في 4٪ بارافورمالدهيد عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة. أعط ثلاث غسلات باستخدام PBS لمدة ساعتين لكل منها. قم بإجراء عملية إزالة اللون وإزالة الدهون عن طريق غمر الكلية الثابتة في سبعة ملليلتر من 50٪ CUBIC-L في أنبوب دائري القاع سعة 14 مليلتر مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة.

بعد ست ساعات ، اغمر الكلية في سبعة ملليلتر من CUBIC-L في أنبوب دائري القاع مقاس 14 ملم مع اهتزاز لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام. قم بتحديث CUBIC-L كل يوم. بمجرد اكتمال إزالة اللون وإزالة الدهون ، استخدم ملعقة توزيع للتعامل مع العينات ، واغسل الكلى ثلاث مرات باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

صبغة مناعية الكلى المخففة في الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول عازل تلطيخ مع رج لطيف في شاكر حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام. بعد ذلك ، اغسل الكلى بنسبة 0.5٪ Triton X-100 في PBS ، المعروف أيضا باسم PBST ، في درجة حرارة الغرفة ليوم واحد. بالنسبة لتلوين الأجسام المضادة الثانوية ، عالج الكلى بالأجسام المضادة الثانوية في مخزن التلوين في الظلام مع هز لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام. قم بإصلاح التلوين بغسل PBST في درجة حرارة الغرفة ليوم واحد.

بعد التثبيت ، اغمر الكلى في 1٪ فورمالديهايد في PB لمدة ثلاث ساعات واغسلها باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات. قم بإجراء مطابقة معامل الانكسار عن طريق غمر الكلى في سبعة ملليلتر من 50٪ CUBIC-R + في أنبوب دائري القاع سعة 14 مليلتر مع الرج لمدة يوم واحد ، متبوعا بالعلاج بسبعة ملليلتر من CUBIC-R + مع الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.