JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 4:09 د • July 8th, 2025
خذ القطع بالتبريد لخزعة الجلد من مريض مرض باركنسون مغلف في وسط تضمين.
يتكون النسيج من بشرة خارجية ، وأدمة كامنة ، ودهون تحت الجلد تعصبها الأعصاب.
اغسل القسم لإزالة وسط التضمين. انقله إلى محلول مانع للنفاذية ، ونفاذية الخلايا وحظر مواقع الارتباط غير المحددة.
اغمر القسم في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية لتحقيق وضع علامات موحدة على الأجسام المضادة ، تسمى تلطيخ عائم الحر.
تدخل الأجسام المضادة إلى الخلايا العصبية وترتبط بمجاميع ألفا سينوكلين الموزعة على طول المحاور - وهو شكل مجمع مميز للأمراض التنكسية العصبية - والهيدرولاز الطرفي للكربوكسيل.
إدخال الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.
عالج بصبغة ربط الحمض النووي الفلورية التي تلطخ النواة.
ضع المنديل على شريحة ، وقم بتطبيق وسيط تثبيت ، وأغلقه بغطاء.
تحت المجهر متحد البؤر ، يكشف التألق من كلا الأجسام المضادة عن وجود مجاميع ألفا سينوكلين على طول محاور الخلايا العصبية الجلدية.
للبدء ، املأ بعض آبار صفيحة 96 بئرا طازجة ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل. انقل الأقسام المراد تحليلها من لوحة التخزين إلى تلك التي تحتوي على محلول الغسيل. اترك الأقسام في محلول الغسيل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل كل قسم إلى بئر فارغ يحتوي على نفس محلول الغسيل ، وكرر الغسيل. بعد ذلك ، أضف محلول غسيل إلى الأقسام ، وانقلها إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول الحظر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة على الأقل وبحد أقصى 4 ساعات.
تمييع الأجسام المضادة الأولية ، المضادة ل PGP9.5 ومضادة ل 5G4 في محلول العمل. انقل الأقسام إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول عمل الأجسام المضادة الأولية واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
في اليوم التالي ، اغسل الأقسام في الآبار التي تحتوي على محلول غسيل كما هو موضح سابقا. تمييع الأجسام المضادة الثانوية - مضاد للأرانب الماعز للكشف عن مضاد PGP9.5 ومضاد للفأر للماعز للكشف عن 5G4 في محلول العمل.
نقل الأقسام المغسولة إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول العمل للأجسام المضادة الثانوية. قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لتجنب تبييض الفلوروفور المقترن بالأجسام المضادة الثانوية ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.
بعد ذلك ، اغسل الأقسام مرتين في محلول الغسيل كما هو موضح سابقا. انقل الأجزاء المغسولة إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من DAPI لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأقسام مرتين في محلول الغسيل كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، قم بتركيب الأقسام على شريحة في الموضع الصحيح ، وتجنب الطي الخاطئ.
أضف بضع قطرات من وسيط التثبيت إلى الشريحة وقم بتغطية القسم بغطاء. دع الشرائح تجف طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتخزين الشرائح في صندوق مناسب عند 4 درجات مئوية ، مع التأكد من تجنب التعرض للضوء.
باستخدام مجهر مضان مقلوب أو مجهر متحد البؤر ، اعرض الأقسام. احصل على الصور بواسطة كاميرا متصلة بالمجهر. بعد ذلك ، استخدم مجهر مضان أو مجهر متحد البؤر لتحليل الإشارات الإيجابية في أقسام ، من حيث التوزيع المكاني وشدة الإشارة ، كما هو موضح في بروتوكول النص.