الكشف عن الأجسام المضادة المضادة للجليكان المنتشرة باستخدام مصفوفة الجليكان المطبوعة

ابدأ بشريحة جليكو وظيفية تتميز بمصفوفات فرعية مطبوعة من الجليكان منظمة في كتل من المصفوفات.

تمثل كل بقعة في المصفوفة الفرعية جليكان مميزا - بوليمر قائم على الكربوهيدرات مع اختلافات في تكوين السكريات الأحادية وطول السلسلة ونمط التفرع.

عالج الرقاقة السكرية بمخزن مؤقت مانع لمنع مواقع التفاعل غير المحددة.

انقل رقاقة الجليكوريب وأدخل مصل الفأر المخفف في مخزن مؤقت مكمل بالفاعل بالسطح لتقليل تراكم الأجسام المضادة. احتضان تحت التحريض.

يعزز التحريض التوزيع المنتظم للمصل ، مما يسهل الارتباط الانتقائي للأجسام المضادة للجليكان بجليكان معينة بناء على الخصائص الجزيئية المميزة.

يغسل بتركيزات متناقصة من محلول حازل يحتوي على مادة خافضة للتوتر السطحي لإزعاج الارتباط والشطف غير المحدد.

تراكب الرقاقة الجليكوتشيب بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع البيوتين المضاد للفأر ، والتفاعل مع الأجسام المضادة المضادة للجليكان وغسلها.

إدخال الستربتافيدين المسمى بالفلوروفور ، والارتباط بالأجسام المضادة الثانوية الحيوية. اغسل وقم بإزالة المحلول الزائد.

امسح رقاقة الجليكوريب ولاحظ وجود بقع مضان مميزة في مواضع مختلفة مما يشير إلى وجود أجسام مضادة منتشرة خاصة بالجليكان في المصل.

قم بإعداد المخزن المؤقت #1 من خلال المخزن المؤقت #4 كما هو موضح في بروتوكول النص. لتحضير رقائق السكر والعينات ، ضع صندوق التخزين مع الشرائح على الطاولة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. افتح الصندوق وانقل رقاقة الجليكو إلى غرفة الحضانة ، والتي يجب أن تكون مكيفة بالفعل بورق ترشيح مبلل للحفاظ على الرطوبة ثابتة داخل الغرفة.

وفي الوقت نفسه ، قم بتخفيف مصل الفئران باستخدام المخزن المؤقت 1 في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. قم بتجانس محلول المصل لمدة 5 ثوان باستخدام خلاط دوامة. بعد التجانس ، احتضان المصل المخفف عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام مائي لتجنب تراكم الغلوبولين المناعي. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 3 دقائق عند 10,000 مرة جم و 25 درجة مئوية.

اجمع المادة الطافية وتخلص من أي مادة مترسبة. ضع الرقاقة الجليكوتشيب بعناية في غرفة الحضانة. احتضنها ب 1 مليلتر من المخزن المؤقت # 3 للتخلص من أي مادة متبقية على سطح الرقاقة الجليكوبية. لمدة 15 دقيقة ، عند 25 درجة مئوية ، أمسك الرقاقة الجليكوبينية في وضع رأسي ، وأعد غسلها ببعض قطرات المخزن المؤقت # 3 باستخدام ماصة باستور بلاستيكية.

بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت بعناية من سطح رقاقة الجليكوبيس باستخدام ورق الترشيح. ضع رقاقة الجليكوتشيب مرة أخرى في غرفة الحضانة. انشر عينة المصل المخففة على سطح رقاقة الجليكوبيه باستخدام ماصة دقيقة. تأكد من تغطية جميع المناطق الجافة من سطح رقاقة الجليكوبيس بعينة المصل المخففة باستخدام طرف الماصة.

احتضان مع التحريك المداري عند 37 درجة مئوية لمدة 1 و 1/2 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة أي عينة زائدة واغمر الرقاقة الجليكوبية لمدة 5 دقائق في المخزن المؤقت # 3 عند 25 درجة مئوية. مرر رقاقة الجليكوريب إلى وعاء به مخزن مؤقت # 4 ، وأخيرا ، اغسل رقاقة الجليكوريب بماء فائق النقاء.

الطرد المركزي رقاقة الجليكوتشيب لمدة 1 دقيقة عند 175 مرة جم و 25 درجة مئوية لإزالة السائل. بعد إعادة رقاقة الجليكوتشيب إلى غرفة الحضانة ، انشر محلول من الماعز المضاد للفأر المترافق مع البيوتين على سطح رقاقة الجليكوتشيب. احتضان مع التحريك المداري عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإزالة الكسر غير المرتبط وكرر خطوات الغسيل.

بعد الطرد المركزي ، قم باحتضان رقاقة الجليكوبيس في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع 2 ميكروغرام لكل مليلتر من محلول الستربتافيدين المقابل المسمى بالفلوروكروم في المخزن المؤقت # 2. بعد العمل في الظلام لإزالة الجزء غير المرتبط وتكرار خطوات الغسيل ، جفف رقاقة الجليكوتشيب عن طريق الهواء.

لمسح المصفوفة ضوئيا ، اترك رقاقة الجليكوريب على الطاولة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة في الظلام. في الوقت نفسه ، قم بتشغيل الماسح الضوئي للشرائح والليزر. أمسك المصفوفة الدقيقة ، حرك رقاقة الجليكو في الفتحة حتى تلامس الخلف. امسح رقاقة الجليكوبيس عن طريق تشغيل Easy Scan، واحفظ المسح كملف .tiff.