تقنية المصفوفة الدقيقة للببتيد لتنميط خصوصية الأجسام المضادة

خذ شريحة مصفوفة دقيقة تحتوي على ببتيدات هيستون مع تعديلات ما بعد الترجمة المستهدفة وغير المستهدفة أو PTMs.

يتم تثبيت الببتيدات عن طريق البيوتين المترافق في أماكن محددة على الشريحة الزجاجية الوظيفية بالستربتافيدين.

البقع أيضا على فلوروفور أخضر متعادل بالبيوتين ، مما يسهل تحديد البقع.

أدخل عازلة مانعة ، مما يمنع تفاعل الأجسام المضادة غير المحددة.

قم بإزالة المخزن المؤقت وجهاز الطرد المركزي لتجفيف الشريحة.

داخل طابعة الشمع ، قم بحدود المصفوفة بالشمع.

موازنة المصفوفة مع مخزن مؤقت تهجين.

احتضان الأجسام المضادة الأولية الخاصة ب PTM المستهدف.

إدخال الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور الأحمر التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة وأجهزة الطرد المركزي لتجفيف الشريحة.

صور الشريحة باستخدام ماسح ضوئي للمصفوفات الدقيقة. يساعد التألق الأخضر في تحديد البقع ، بينما يشير التألق الأحمر إلى تفاعل الأجسام المضادة PTM ، مما يدل على خصوصية الأجسام المضادة.

يوضح التعرف على PTM المستهدف خصوصية الجسم المضاد ، بينما يشير التعرف على PTMs غير المستهدفة إلى تفاعل الأجسام المضادة المتبادلة.

مسترشدا بخريطة لوحة المصدر ، قم بتحميل 1 إلى 2 ميكرولتر من كل ميزة ببتيد في الآبار المخصصة لواحد أو أكثر من الألواح الصغيرة الحجم 384 بئرا. قم بتخفيف كل ميزة عشرة أضعاف باستخدام مخزن مؤقت لطباعة المصفوفات الدقيقة للبروتين 1x ، مكمل ب 1٪ من ألبومين مصل الأبقار ، و 5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من البيوتين المسمى بالفلورسين. ثم ، قم بالطرد المركزي للألواح عند 500 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بإفراغ حاوية النفايات لطابعة المصفوفة الدقيقة. املأ محلول الغسيل في حاويات المرطب بالماء المقطر المعقم. أدخل معلمات شريحة الصفيف في برنامج طابعة المصفوفة الدقيقة.

اضبط إجراء الغسيل على غسل لمدة ثانية واحدة مع غمر واحد ، ثم الغسيل لإعادة غمس المسامير خمس مرات ، والرطوبة إلى 60٪. ثم أدخل شرائح زجاجية مطلية بالستربتافيدين في أسطوانات الركيزة. قم بتحميل الأسطوانات في مصعد الصوانى السطحي. أدخل لوحات المصدر في حاملات الألواح ، وقم بتحميل الحوامل في مصعد لوحة المصدر. قم بتشغيل عملية الطباعة.

ثم قم بإزالة أسطوانات الركيزة من الأداة. قم بحظر الشرائح المطبوعة باستخدام المخزن المؤقت لحجب المصفوفة الدقيقة للبروتين 1x لمدة 30 دقيقة أثناء الرج. بعد ذلك ، اغسل الشرائح في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. كرر الغسيل مع مجموعة جديدة من PBS. جفف الشرائح بالطرد المركزي لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بتسخين طابعة شمع المصفوفة الدقيقة على حرارة 85 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، أو حتى يذوب الشمع. بعد ذلك ، أدخل شريحة ، بحيث يكون الجانب المطبوع لأسفل ، في الحامل ، وقم بمحاذاة الحامل مع قالب الطابعة. اجعل القالب ملامسا للشريحة ، واستمر لمدة ثانيتين. بعد ذلك ، قم بإزالة الشريحة بسرعة من الحامل وافحص حدود الشمع للتحقق من أن المصفوفات مغلقة بشكل صحيح. قم بتخزين الشرائح المقسمة على حرارة 4 درجات مئوية في منطقة جافة ومظلمة.

لبدء إجراء التهجين ، ضع شريحة مصفوفة مقسمة في طبق بلاستيكي ، وقم بتغطية الشريحة بمخزن مؤقت للتهجين. قم بموازنة الشريحة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية أثناء الاهتزاز بسرعة منخفضة. جفف الشريحة عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي منزلق ميكرو في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 5 ميكرولترات من كل محلول جسم مضاد هيستون PTM إلى بئرين على الأقل من المصفوفة ، واحتضن عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة ، واغسل المصفوفة باستخدام PBS البارد ثلاث مرات ، لمدة 5 دقائق لكل منها ، عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، احتضان المصفوفة في محلول أجسام مضادة ثانوية مترافقة بصبغة فلورية لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، في حالة عدم وجود ضوء. اغسل الشريحة ثلاث مرات باستخدام PBS بارد كما كان من قبل.

اغمس المصفوفة في درجة حرارة الغرفة 0.1x PBS لإزالة الأملاح الزائدة ، وجفف الشريحة عن طريق الطرد المركزي لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة. قم بتصوير الشريحة باستخدام ماسح ضوئي للمصفوفات الدقيقة بدقة لا تقل عن 25 ميكرون.