توطين مناعي لبروتينات أرابينوجالاكتان والبكتين في الأنسجة النباتية

خذ شريحة مع آبار التفاعل التي تحتوي على أقسام رقيقة من الأنسجة النباتية المختلفة. يتم تثبيت الأنسجة وتضمينها داخل راتنج للتلوين المناعي.

ضع الشريحة داخل غرفة حضانة مظلمة ورطبة لمنع التعرض للضوء وتبخر الكاشف أثناء الخطوات اللاحقة.

أدخل محلول مانع لمنع تفاعل الأجسام المضادة غير المحدد.

اغسل لإزالة محلول الانسداد الزائد ، ثم أضف الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالمستضد واحتضنها.

ترتبط الأجسام المضادة بمستضداتها المستهدفة ، وهي بروتينات أرابينوجالاكتان والبكتين في جدار الخلية.

إدخال الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

اغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة ، وقم بتطبيق صبغة فلورية ترتبط بالسليلوز ، مع وضع علامات على جدار الخلية.

أضف وسيط التثبيت وأغلقه بغطاء غطاء.

تحت المجهر ، يساعد التألق من الصبغة والأجسام المضادة المرتبطة في تصور السليلوز في جدران الخلايا النباتية المتوضعة مع بروتينات أرابينوجالاكتان أو البكتين ، مما يدل على توزيعها الخاص بالأنسجة.

لتحضير غرفة حضانة لشرائح التفاعل ، ضع بعض المناشف الورقية المبللة في الجزء السفلي من صندوق أطراف الماصة ولف الصندوق بورق الألمنيوم. انقل الشرائح من الصندوق إلى غرفة الحضانة. ماصة 50 ميكرولتر من محلول الحجب في كل بئر. بعد احتضان الشريحة لمدة 10 دقائق ، قم بإزالة محلول الحظر. ثم اغسل جميع الآبار مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد تحضير محاليل الأجسام المضادة الأولية كما هو موضح في المخطوطة ، قم بإجراء غسيل نهائي للآبار بالماء المقطر منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.

الماصة محلول الجسم المضاد الأساسي في آبار التفاعل. بعد ذلك، قم بإدخال محلول الانسداد في آبار التحكم. أغلق غرفة الحضانة. اتركه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، ثم ضعه في الثلاجة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تحضير محلول 1٪ من الجسم المضاد الثانوي في محلول الحظر. ستكون هناك حاجة إلى ما يقرب من 40 ميكرولتر لكل بئر.

غطي المحلول بورق الألمنيوم. اغسل آبار شريحة التفاعل مرتين باستخدام PBS ، ومرة بالماء المقطر منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق في كل مرة. تأكد من عدم وجود محلول مانع أو رواسب في الآبار. ماصة محلول الأجسام المضادة الثانوية في جميع الآبار. احتضن الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 4 ساعات.

مرة أخرى ، اغسل آبار شريحة التفاعل مرتين باستخدام PBS ، ومرة واحدة بالماء المقطر منزوع الأيونات. ثم أضف قطرة من الأبيض الكالكوفلوري إلى كل بئر. بدون غسل ، أضف قطرة من وسط التركيب إلى كل بئر ، وقم بتغطية كل بئر بغطاء. راقب أقسام العينة في شريحة التفاعل باستخدام مجهر فلوري.

لكل ملاحظة ، استخدم مرشح الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن جدران الخلايا الملطخة بالفلور الكالكوفلوري ومرشح FITC للكشف عن تحديد المناعة. للحصول على تصور أفضل للنتائج ، استخدم ImageJ أو برنامج تحليل صور مماثل لدمج كل صورة مرشح للأشعة فوق البنفسجية مع صورة مرشح FITC المقابلة.