استخدام شطيرة ELISA لتحديد محتوى البروتين السكري المناعي في اللقاح

ابدأ بلوحة فحص تخميل مغطاة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالبروتين السكري المناعي لداء وعامل مانع لمنع التفاعلات غير المحددة.

إدخال لقاحات داء المخففة بشكل متسلسل واختبارها مع انخفاض محتوى البروتين السكري. أغلق اللوحة لمنع التلوث.

أثناء الحضانة ، تتفاعل البروتينات السكرية المناعية مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المطلية عبر موقع مستضد محدد.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الفيلم ، وشفط المادة الطافية ، واغسل اللوحة.

تراكب مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالبروتين السكري المترافق بالإنزيم والتي ترتبط بموقع مستضد مختلف على البروتين السكري ، وتشكل مركبا مناعيا.

أضف محلولا يحتوي على ركيزة وكروموجين. عندما تتفاعل الركيزة مع الإنزيم ، فإنها تسبب أكسدة الكروموجين ، مما يؤدي إلى تغيير لون المحلول.

أضف محلول توقف لتعطيل الإنزيمات.

قم بقياس الامتصاص وإنشاء منحنى مرجعي باستخدام قيم اللقاح المرجعية.

تحديد المنطقة التي توجد فيها علاقة خطية بين الامتصاص ومحتوى البروتين السكري لتخفيفات اللقاح المرجعية. بعد ذلك ، استقراء محتوى البروتين السكري في تخفيفات لقاح الاختبار بناء على الامتصاص الذي يقع داخل هذه المنطقة.

لغسل الشفرة ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى كل بئر. بعد ذلك ، قم بالشفيق بعناية ونقل محتوى البئر إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2.6٪. كرر عملية الغسيل هذه خمس مرات أخرى لغسل اللوحة الحساسة على نطاق واسع.

بعد ذلك ، اقلب الصفيحة الدقيقة ، واتركها تجف على قطعة من الورق الماص في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. إعادة تكوين اللقاح المرجعي في مليلتر واحد من الماء المقطر بحيث يكون التركيز النهائي للبروتين السكري لفيروس داء 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. تحضير مخفف بمقدار 10 أضعاف من اللقاح المرجعي المعاد تكوينه في المخفف للوصول إلى تركيز البروتين السكري لفيروس داء بمقدار ميكروغرام واحد لكل مليلتر.

بعد ذلك، قم بإجراء ستة تخفيفات مزدوجة متسلسلة لهذا اللقاح المرجعي في المخفف كما هو موضح في الجدول الأول من بروتوكول النص. قم بتوزيع 200 ميكرولتر من المادة المخففة في آبار مكررة لتكون بمثابة عنصر تحكم فارغ ، و 200 ميكرولتر لكل بئر لكل تخفيف لقاح مرجعي في نسختين.

بعد ذلك، قم بإعداد مخفف بمقدار 10 أضعاف من اللقاح المختبر في المخفف، وإعداد سبع تخفيفات تسلسلية مزدوجة للقاح المختبر في المخفف كما هو موضح في الجدول الثاني من بروتوكول النص. وزع 200 ميكرولتر من كل تخفيف لقاح تم اختباره في نسختين على كل بئر من الصفيحة الدقيقة. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بغشاء لاصق ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الفيلم ، والاستنشاق بعناية ، ونقل محتويات كل بئر إلى مستلم يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2.7٪. لغسل الطبق ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى كل بئر. استنشق بعناية ، وانقل محتويات كل بئر إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2.6٪.

كرر عملية الغسيل خمس مرات أخرى لإزالة المستضد غير المرتبط. والحفاظ على أدوات تشذيب بروتين G المرتبطة بالجسم المضاد المطلي. اقلب الصفيحة الدقيقة المغسولة واتركها تجف على قطعة من الورق الماص في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من التخفيف الموصى به للجسم المضاد أحادي النسيلة D1 المسمى بالبيروكسيداز في مخفف لكل بئر.

قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بغشاء لاصق ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة الفيلم ، والاستنشاق بعناية ، ونقل محتويات كل بئر إلى مستلم يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2.6٪. لغسل الصفيحة الدقيقة ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى كل بئر.

استنشق بعناية ، وانقل محتويات كل بئر إلى متلقي يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2.6٪. كرر عملية الغسيل هذه خمس مرات أخرى لإزالة الجسم المضاد غير المرتبط بعلامة البيروكسيداز. اقلب صفيحة الغسيل واتركها تجف على قطعة من الورق الماص في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من محلول كروموجين الركيزة في كل بئر. أغلق الصفيحة الدقيقة بفيلم ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 50 ميكرولترا من محلول التوقف في كل بئر لإيقاف التفاعل.

امسح الجزء السفلي من الشفرة الدقيقة بعناية ، وضعها في مقياس الطيف الضوئي. حدد الكثافة الضوئية عند 492 نانومتر لجميع الآبار المستخدمة. اجمع هذه البيانات في ملف جدول بيانات لتحليلها. بعد ذلك ، قم بإنشاء مخططات لكل من منحنى اللقاح المرجعي وقيم الكثافة الضوئية كما هو موضح في بروتوكول النص.