اختبار مناعي متعدد الإرسال قائم على الخرزة لتحديد أهداف السيتوكين المتعددة

خذ صفيحة متعددة الآبار مع مرشحات في القاعدة.

أضف عينة اختبار تحتوي على سيتوكينات مختلفة.

أضف مجموعات مختلفة من الكريات المجهرية متباينة حسب الحجم وشدة التألق الداخلي.

يتم اقتران كل مجموعة مع جسم مضاد يستهدف سيتوكين معين.

احتضان اللوحة في الظلام تحت التحريض.

ترتبط الأجسام المضادة بالسيتوكينات المستهدفة ، مما يؤدي إلى جملتها على الكريات المجهرية.

ضع مكنسة كهربائية لإزالة السيتوكينات غير المرتبطة. يتم الاحتفاظ بالسيتوكينات المرتبطة بالكرة المجهرية بسبب حجم المسام الأصغر للغشاء.

أضف مزيجا من الأجسام المضادة للكشف المترافق مع البيوتين التي ترتبط بالسيتوكينات المرتبطة بالكرة المجهرية.

أضف ستربتافيدين مترافق بالفلورسنت واحتضانه في الظلام تحت التحريض. يرتبط الستربتافيدين بالبيوتين ، مما يؤدي إلى شل حركة المراسل على مركب الكرة المجهرية.

قم بإزالة الجزيئات غير المرتبطة وإعادة تعليق المجهرية.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حدد السيتوكينات المرتبطة عن طريق تحديد الحجم والتألق الداخلي للكريات المجهرية.

لتحديد كمية السيتوكين المعين ، قم بقياس شدة مضان المراسل.

لإجراء الفحص ، اترك جميع الكواشف تسخن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

تستخدم ألواح ترشيح البولي بروبلين في هذا العرض التوضيحي. من الضروري للغاية أن تظل اللوحة منتصبة أثناء إجراء الفحص بأكمله ، بما في ذلك خطوات الغسيل ، لتجنب فقدان الخرز.

قم ببلل ورق الترشيح مسبقا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1x إلى كل بئر ، واترك اللوحة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة حجم المخزن المؤقت باستخدام مشعب التفريغ. امسح عازلة الغسيل الزائدة من أسفل اللوحة عن طريق الضغط على اللوحة على كومة من المناشف الورقية النظيفة. ثم ضع اللوحة فوق غطاء اللوحة المقلوب.

بالنسبة لعينات الطاف لزراعة الخلايا ، أضف 25 ميكرولترا من مخزن الفحص إلى جميع الآبار. أضف 25 ميكرولترا من كل معيار إلى الآبار القياسية. أخيرا ، أضف 25 ميكرولترا من كل عينة إلى آبار العينة. دوامة الخرز المختلطة لمدة 30 ثانية. ثم أضف 25 ميكرولترا من الخرز المختلط إلى كل بئر ، مع رج زجاجة الخرزة بشكل متقطع لتجنب استقرار الخرز.

أغلق اللوحة باستخدام مادة مانعة للتسرب من الألواح. بمجرد إغلاقها ، لف اللوحة بأكملها ، بما في ذلك غطاء اللوحة المقلوب ، بورق الألمنيوم. ضع اللوحة على شاكر اللوحة ، وثبتها ، ورجها عند حوالي 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بدون قلب ، ضع اللوحة على مشعب الفراغ وقم بتطبيق الفراغ كما كان من قبل. ثم أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1x إلى كل بئر.

قم بإزالة محتويات آبار لوحة الفحص عن طريق الترشيح الفراغي. امسح عازلة الغسيل الزائدة من أسفل اللوحة باستخدام وسادة ماصة أو مناشف ورقية قبل تكرار هذه الخطوة مرة أخرى. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من الأجسام المضادة للكشف إلى كل بئر. بعد إغلاق اللوحة باستخدام مادة مانعة للتسرب جديدة ، قم بلف اللوحة بأكملها ، بما في ذلك غطاء اللوحة المقلوب ، بورق الألمنيوم.

ضع الطبق على شاكر اللوحة ورجه عند حوالي 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بدون تنظيف بالمكنسة الكهربائية ، أضف 25 ميكرولترا من كاشف الستربتافيدين فيكوريثيرين مباشرة إلى كل بئر. أغلق الطبق ولفه كما كان من قبل. ثم. ضع الطبق على شاكر الطبق ورجه بسرعة 500 دورة في الدقيقة تقريبا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد تكرار خطوة الترشيح الفراغي مرتين ، أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1x إلى كل بئر. أعد تعليق الخرز على شاكر الطبق لمدة 1 دقيقة. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل العينات من لوحة المرشح إلى أنابيب FACS لقراءة العينات على مقياس التدفق الخلوي.