التلوين المناعي للخلايا المغلفة في نظام هيدروجيل ثلاثي الأبعاد

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على خلايا ثدييات مغلفة في نظام هيدروجيل يحاكي بيئة المصفوفة الطبيعية خارج الخلية.

قم بإزالة وسط الثقافة. عالج باستخدام مخزن مؤقت للتثبيت لربط البروتينات ، مع الحفاظ على سلامة الخلية.

أضف محلولا يحتوي على منظف لاختراق الغشاء الخلوي.

أدخل محلول مانع لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة في الخطوات اللاحقة.

أضف كوكتيل الأجسام المضادة الأولية التي تدخل الخلايا وترتبط على وجه التحديد بالخيوط الوسيطة السيتوبلازمية وعامل النسخ المستهدف.

قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. أدخل الأجسام المضادة الثانوية المصنفة بالفلورسنت وصمة عار نووية لتسمية الحمض النووي بالفلورسنت.

قم بإزالة الجزيئات غير المرتبطة.

قم بتركيب ثقافة الهيدروجيل على شريحة باستخدام وسيط تثبيت.

استخدم مجهر متحد البؤر لمراقبة الخلايا الملطخة بالمناعة.

أولا ، استنشق الوسط من كل بئر. ثم اغسل الآبار ب 1 ملليلتر من DPBS الدافئ. بعد اكتمال الغسيل ، أضف 750 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى كل بئر. ثم احتضن الطبق المكون من 24 بئرا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، استنشق محلول التثبيت من كل بئر ، وتخلص من المثبت في حاوية نفايات خطرة. بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من DPBS إلى العينة وتخلص من DPBS على الفور في حاوية نفايات خطرة.

بعد ذلك ، أضف 750 ميكرولتر من محلول النفاذية لنفاذية العينة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على الروك ، بمعدل 15 دورة في الدقيقة. بعد ساعة واحدة ، قم بشفط محلول النفاذية ، وأضف 750 ميكرولتر من محلول الحجب إلى العينة. اترك العينة على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. ثم قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية المرغوبة بمحلول تخفيف الجسم المضاد.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد لكل عينة. احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، استنشق محلول الأجسام المضادة الأساسي. ثم اغسل العينات باستخدام PBST لمدة ساعة ثلاث مرات ، في درجة حرارة الغرفة ، بمعدل 15 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة و 5 مجم / مل من محلول مخزون DAPI لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. ثم أضف 500 ميكرولتر من المحلول إلى كل عينة. بعد ذلك ، استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية اللوحة المكونة من 24 بئرا واحتضان اللوحة عند 4 درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بشفط محلول الأجسام المضادة الثانوية واغسل العينات باستخدام PBST ثلاث مرات ، كل منها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على هزاز. بعد ذلك ، ضع قطرة من وسيط التثبيت الصلب على سطح شريحة زجاجية وضع العينة على وسط التركيب. أخيرا ، استخدم طلاء الأظافر لإغلاق العينات بشريحة الغطاء الزجاجي لمنع التلوث أو حركة العينة.