تقييم تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية باستخدام صبغة مؤشر الكالسيوم

ابدأ بتعليق الخلايا التائية للفأر وأدخل صبغة مؤشر الكالسيوم - إستر Indo-1-acetoxymethyl.

تدخل الصبغة إلى الخلايا ، حيث تشق الإسترازات داخل الخلايا مجموعة أسيتوكسي ميثيل لتشكيل Indo-1 غير منفذ للغشاء ، والذي يظهر مضان مميز في أشكال خالية من الكالسيوم ومرتبطة بالكالسيوم.

أضف الأجسام المضادة لمستقبلات Fc لمنع مواقع التفاعل غير المحددة.

إدخال الأجسام المضادة المسماة بالفلوروفور لتلطيخ مجموعات فرعية من الخلايا التائية.

قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة والبقع بصبغة قابلة للحياة تلطخ الخلايا الحية والميتة بشكل تفاضلي.

في قياس التدفق الخلوي ، اكتشف في البداية التألق الخافت للخلايا الحية وحدد الخلايا التائية الموسومة بالفلوروفور ، متبوعا بقياس التألق الهندي -1 داخل هذه الخلايا.

عالج بالأجسام المضادة المضادة ل CD3 ، والتي تتفاعل مع مركب مستقبلات الخلايا التائية CD3 وتنشط مسارات إشارات الخلايا التائية ، مما يؤدي إلى تدفق الكالسيوم إلى العصارة الخلوية.

تتفاعل صبغة Indo-1 مع أيونات الكالسيوم المنبعثة ، مما يؤدي إلى تحويل مضان الصبغة من الأزرق إلى البنفسجي.

يؤكد التحول في مضان Indo-1 من الحالات الخالية من الكالسيوم إلى الحالات المرتبطة بالكالسيوم تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية.

للبدء ، قم بإعداد محلول مخزون 1 ميكروغرام لكل ميكرولتر من Indo-1 AM عن طريق إضافة 50 ميكرولتر