تقييم تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية باستخدام صبغة مؤشر الكالسيوم

ابدأ بتعليق الخلايا التائية للفأر وأدخل صبغة مؤشر الكالسيوم - إستر Indo-1-acetoxymethyl.

تدخل الصبغة إلى الخلايا ، حيث تشق الإسترازات داخل الخلايا مجموعة أسيتوكسي ميثيل لتشكيل Indo-1 غير منفذ للغشاء ، والذي يظهر مضان مميز في أشكال خالية من الكالسيوم ومرتبطة بالكالسيوم.

أضف الأجسام المضادة لمستقبلات Fc لمنع مواقع التفاعل غير المحددة.

إدخال الأجسام المضادة المسماة بالفلوروفور لتلطيخ مجموعات فرعية من الخلايا التائية.

قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة والبقع بصبغة قابلة للحياة تلطخ الخلايا الحية والميتة بشكل تفاضلي.

في قياس التدفق الخلوي ، اكتشف في البداية التألق الخافت للخلايا الحية وحدد الخلايا التائية الموسومة بالفلوروفور ، متبوعا بقياس التألق الهندي -1 داخل هذه الخلايا.

عالج بالأجسام المضادة المضادة ل CD3 ، والتي تتفاعل مع مركب مستقبلات الخلايا التائية CD3 وتنشط مسارات إشارات الخلايا التائية ، مما يؤدي إلى تدفق الكالسيوم إلى العصارة الخلوية.

تتفاعل صبغة Indo-1 مع أيونات الكالسيوم المنبعثة ، مما يؤدي إلى تحويل مضان الصبغة من الأزرق إلى البنفسجي.

يؤكد التحول في مضان Indo-1 من الحالات الخالية من الكالسيوم إلى الحالات المرتبطة بالكالسيوم تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية.

للبدء ، قم بإعداد محلول مخزون 1 ميكروغرام لكل ميكرولتر من Indo-1 AM عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من DMSO إلى قارورة تحتوي على 50 ميكروغراما من Indo-1 AM. قم بتخفيف محلول المرق إلى حجم مناسب من cRPMI بتركيز 6 ميكروغرام لكل ملليلتر.

ضع الوسط في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم هذه الوسيطة لتخفيف معلق الخلية المعد مسبقا بنسبة 1 إلى 1 للحصول على 5 إلى 6 ملايين خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، إلى لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا ، أضف 1 مليلتر من تعليق الخلية لكل بئر ، لكل حالة تجريبية.

قم بإعداد عينة تحكم أحادية اللون ل Indo-1 AM الخالية من الكالسيوم عن طريق إضافة EGTA إلى الخلايا المحملة بالصبغة Indo-1. إصلاح بئر للتحكم البيولوجي السلبي بدون فلوروفورات أو صبغة Indo-1. قم بإعداد عنصر تحكم إيجابي Indo-1 عن طريق إضافة الأيونومايسين بتركيز 50 ميكرومول إلى تعليق الخلية المحمل بالصبغة في مقياس التدفق الخلوي.

أيضا ، قم بإعداد بئر للتحكم في البقعة المفردة لمجموعات الخلايا الإضافية ، باستخدام الفلوروفورات المترافقة بالأجسام المضادة. ثم أضف 2 ميكروغرام من الجسم المضاد الذي يحجب مستقبلات FC لكل مليون خلية ، واحتضن اللوحة لمدة 45 دقيقة ، مع النقر كل 15 دقيقة لإعادة تعليق الخلايا.

بعد الحضانة ، قم بخلط وإزالة الحجم الكامل للخلايا من اللوحة وإضافتها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي وصب المادة الطافية. بمجرد غسل الخلايا ب 1 مليلتر من cRPMI الدافئ مسبقا ، قم بالحبيبات مرة أخرى ، وصب المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في 1 مليلتر من cRPMI ، واحتضان كل أنبوب ، مع ترك الجزء العلوي من الأنبوب مفتوحا قليلا لتبادل الغازات ، مما يسمح بإزالة الأسترة الكاملة لاسترات AM داخل الخلايا. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي من جميع الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم التي يحددها المستخدم ، وأضفها إلى الخلايا المريحة لمدة 1 مليلتر من حجم الخلية.

بعد الراحة ، قم بتكسير الخلايا ، واغسل الحبيبات عن طريق التعليق في 1 مليلتر من cRPMI المبرد إلى 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة ، وضع الأنابيب على الجليد. أعد تعليق العينات الفردية في 500 ميكرولتر من cRPMI الخالي من الفينول الأحمر ، باستخدام أنبوب تدفق البوليسترين سعة 5 ملليلتر مع غطاء.

للحفاظ على درجة الحرارة باستخدام تحليل تدفق الكالسيوم ، قم بإعداد حمام حبة عن طريق إضافة حبات الاستحمام إلى حمام مائي صغير ، وتسخينه حتى 37 درجة مئوية. قم بقص أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر بعناية إلى نصفين ، وتخلص من الجزء العلوي من الأنبوب. املأ 3/4 الأنبوب المتبقي بخرز الحمام ، واتركه يصل إلى 37 درجة مئوية في حمام الخرز.

ضع حمام الخرزة بالقرب من مقياس التدفق الخلوي ، جنبا إلى جنب مع رف الستايروفوم لوضع الأنبوب. قبل التحليل على مقياس التدفق الخلوي ، قم بتسخين الأنابيب بشكل فردي إلى 37 درجة مئوية لمدة سبع دقائق. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج مقياس التدفق الخلوي ، وانقر فوق علامة التبويب المكتبة.

بعد ذلك ، حدد علامات الفلورسنت لإضافة Indo-1 المرتبط بالكالسيوم و Indo-1 الخالي من الكالسيوم. بعد ذلك ، حدد ليزر الأشعة فوق البنفسجية ضمن مجموعات علامات الفلورسنت ، وانقر فوق إضافة إضافية لإضافة اسم علامة الفلورسنت. اختر الإثارة بالليزر والطول الموجي للانبعاث، ثم انقر فوق حفظ.

تابع إلى الإعداد التجريبي. انقر فوق علامة التبويب اكتساب. افتح تجربة جديدة أو أنشئها، وأضف علامات الفلورسنت المطلوبة إلى التجربة. قم بإنشاء مجموعة مرجعية ومجموعة عينة جديدة للتجربة، وقم بتسمية كلتا المجموعتين.

ضمن علامة التبويب عمليات الاستحواذ ، اضبط الأحداث للتسجيل على الحد الأقصى عند 10 ملايين ، وإيقاف الحجم إلى الحد الأقصى للحجم البالغ 3,000 ميكرولتر ، ووقت التوقف إلى 36,000 ثانية كحد أقصى. احصل على عناصر تحكم أحادية اللون للأجسام المضادة المترافقة المحددة من قبل المستخدم ، والمضمنة في اللوحة متعددة الألوان ، وللصبغة الوظيفية Indo-1.

أضف 50 ميكرومول من الأيونومايسين إلى التحكم الإيجابي Indo-1 المرتبط بالكالسيوم والدوامة. أضف أنبوب التدفق إلى لوحة حقن العينة، ثم انقر فوق تسجيل. بعد ذلك، أضف عنصر تحكم Indo-1 السلبي الخالي من الكالسيوم إلى مقياس التدفق الخلوي، وانقر فوق تسجيل.

قم بفك مزج عناصر التحكم أحادية اللون بالنقر فوق الزر Unmix. بمجرد اكتمال فك الخلط، قم بإنشاء مخططات متسلسلة باستخدام ورقة العمل غير المختلطة، مثل SSCA مقابل FSCA لإزالة الحطام من العينة، و SSCA مقابل SSCH لإزالة المضاعفات.

ثم قم بإنشاء بوابات بالنقر فوق المؤامرة. أضف قطعة أرض إلى ورقة العمل، وانقر نقرا مزدوجا داخل البوابة لإنشاء مجموعة مسورة من الخادم. استمر حتى يتم حساب جميع السكان المهمين. بعد ذلك ، قم بتسخين عينات التحكم أحادية اللون المعدة مسبقا إلى 37 درجة مئوية للتحليل التسلسلي.

قم بإعداد برنامج قياس التدفق الخلوي ، وقم بتشغيل الماء منزوع الأيونات لمدة 2 إلى 3 دقائق لضمان استقرار السائل لمقياس التدفق الخلوي. قم بإعداد مخططات متسلسلة على ورقة العمل غير المختلطة عن طريق إنشاء بوابات باستخدام أزرار بوابة المضلع أو المستطيل أو القطع الناقص لتضمين المحتوى المستهدف.

نقرا مزدوجا داخل البوابة، وقم بتغيير معلمات المحور y و x إلى SSCA مقابل SSCH. أكمل تحديد معلمات المحور بالنقر بزر الماوس الأيسر على المحور. قم بإنشاء مخطط باستخدام SSCA مقابل إشارة صبغة الجدوى. بوابة الخلايا الحية ، وهي تلطيخ صبغة سلبية أو أمينة.

سوف تتجمع الخلايا الحية سالبة للتلطيخ الحي الميت عند علامة الصفر على كل من المحورين y و x. انقر نقرا مزدوجا فوق المخطط الداخلي لإنشاء مخطط جديد يحتوي فقط على الخلايا الليمفاوية الحية أحادية الخلية. قم بتغيير المحور y إلى واحد مقابل الوقت على المحور x لتصور تدفق الكالسيوم.

بعد ذلك ، ضع العينة البيولوجية الدافئة في SIT للجهاز. قم بتشغيل العينات من 2,500 إلى 3,000 حدث في الثانية بمعدل تدفق متوسط لتصور تدفق الكالسيوم في عدد محدود من مجموعات الخلايا. أضف الأنبوب التالي إلى حمام الخرز.

في التحكم في الاستحواذ، اضغط على تسجيل لتسجيل البيانات الأولية لمدة 30 ثانية للحصول على مستوى أساسي من إشارات الكالسيوم في العينة. ثم انقر فوق إيقاف ، وقم بإزالة الأنبوب من منفذ حقن العينة. أضف 30 ميكروغراما من مضاد CD3 غير المقترن مباشرة إلى أنبوب العينة لبدء تدفق الكالسيوم.

ضع الأنبوب بسرعة مرة أخرى على منفذ حقن العينة ، واضغط على تسجيل في البرنامج. سجل البيانات لمدة سبع دقائق ، وشاهد الوقت المنقضي بموجب ضوابط الاستحواذ في البرنامج. ثم اضغط على إيقاف في البرنامج.