JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 4:24 د • July 8th, 2025
خذ أنبوبا يحتوي على معلق من البكتيريا المعوية البشرية.
أضف جزيئات شبيهة بفيروس نوروفيروس البشري ، أو VLPs. تحتوي VLPs على قفيصة فيروسية سليمة ولكنها تفتقر إلى الحمض النووي الريبي الجيني ، مما يجعلها غير معدية للبشر.
أثناء الحضانة ، ترتبط بروتينات قفيصة VLP بكربوهيدرات معينة يتم التعبير عنها على سطح البكتيريا ، وتشكل مجمعات بكتيريا VLP.
جهاز طرد مركزي لحبيبات المجمعات والتخلص من VLPs غير المرتبطة.
أدخل محلول حجب يحتوي على البروتين لمنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة ، مما يقلل من تلطيخ الخلفية في الخطوات اللاحقة.
أضف الأجسام المضادة الخاصة ب VLP المسمى بالفلورسنت واحتضنها.
ترتبط الأجسام المضادة بمواقعها المستهدفة على قفيصة VLP ، مع تسمية مجمعات بكتيريا VLP.
جهاز طرد مركزي لحبيبات المجمعات. تخلص من الأجسام المضادة غير المرتبطة وأعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت لقياس التدفق الخلوي.
باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، اكتشف إشارات التألق المنبعثة من مجمعات بكتيريا VLP ، مما يسمح بتحديد النسبة المئوية للبكتيريا المرتبطة في العينة.
بعد تحضير الكواشف والأجسام المضادة والبكتيريا كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتجميع جميع المواد في خزانة السلامة البيولوجية BSL II.
يتم سرد الجسيمات الشبيهة بالفيروسات للنوروفيروس البشري على أنها مسببات الأمراض BSL II ، ويجب إجراء جميع الأعمال التي يتم إجراؤها باستخدام VLPs في خزانة معتمدة للسلامة البيولوجية.
أضف 10 ميكروغرامات من نوروفيروس VLPs البشري إلى كل أنبوب من البكتيريا ، واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع دوران مستمر. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 10,000 مرة جم لمدة 5 دقائق.
قم بشفط والتخلص من المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مليلتر من PBS. بعد تكرار خطوات الغسيل مرة واحدة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب مرة أخرى عند 10,000 مرة جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات بكتيريا VLP في 150 ميكرولتر من 5٪ مانع العازلة.
الخطأ الشائع الذي يحدث هو تبديل الأنابيب وإضافة العلاج الخاطئ. لمنع ذلك ، رتب جميع الأنابيب في خطوط تتوافق مع العلاج الصحيح ، وأضف علاجا واحدا دفعة واحدة إلى الأنابيب.
لكل عينة بكتيرية ، قم بإعداد 50 ميكرولترا من الجسم المضاد لنوروفيروس G2 البشري المخفف. باستخدام مخزن مانع بنسبة 5٪ ، قم بتخفيف الجسم المضاد من 1 إلى 125 لعينات حالة الإشريكية القولونية. تحضير 50 ميكرولترا من الجسم المضاد للنمط المتمزوج المخفف لكل عينة بكتيرية باستخدام نفس نسب التخفيف. قسم كل عينة فحص مرفق إلى حصص 350 ميكرولتر عن طريق نقلها إلى أنابيب طرد مركزي نظيفة سعة 1.5 ملليلتر.
لإنشاء عناصر تحكم غير ملوثة ، أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للحجب إلى أول حصة من كل عينة بكتيرية. بالنسبة للعينات الملطخة ، أضف 50 ميكرولترا من تخفيف الجسم المضاد G2 إلى المجموعة الثانية من الحصص الصغيرة. قم بإنشاء عناصر تحكم النمط المتماثل عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من الجسم المضاد للنمط المتماثل المخفف إلى المجموعة الثالثة من الحصص الفرعية.
احتضان جميع العينات على الجليد وفي الظلام لمدة 30 دقيقة. ثم ، قم بالطرد المركزي لجميع العينات عند 10,000 مرة جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المواد الطافية وأعد تعليق كل عينة في 150 ميكرولتر من FCSB. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي لجميع العينات عند 10,000 مرة جم لمدة 5 دقائق. مرة أخرى ، تخلص من المواد الطافية وأعد تعليق العينات في 100 ميكرولتر من FCSB.
بعد الطرد المركزي للعينات مرة أخيرة والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق العينات في 150 ميكرولتر من FCSB. انقل كل عينة إلى أنبوب يحتوي على 400 ميكرولتر من FCSB بحجم إجمالي يبلغ 550 ميكرولتر. قم بتخزين العينات على حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي.