طريقة تللوين مناعي متعددة الإرسال باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة

خذ قسما ثابتا ونافذا للغدة الكظرية يتكون من قشرة ونخاع. عالجها بمحلول حمضي مغلي ، وكسر الروابط المتقاطعة الناجمة عن التثبيت لكشف القناع عن المستضد.

قم بحظر مواقع الارتباط غير المحددة وأدخل الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بعلامات خاصة بالقشرة.

أضف الأجسام المضادة الثانوية البيوتينيل التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية والبيروكسيداز المترافق بالستربتافيدين المرتبط بالبيوتين.

أدخل تيراميد وبيروكسيد الهيدروجين الموسوم بالفلوروفور.

تستخدم البيروكسيداز المجمدة بيروكسيدات الهيدروجين لتنشيط التيراميد ، الذي يرتبط بالبروتينات القريبة ، مما يضع علامة على القشرة.

بعد ذلك ، عالج القسم بمخزن الغليان لتجريد الأجسام المضادة المرتبطة.

إدخال نفس الأجسام المضادة الأولية التي يتم إنشاؤها من الأنواع المضيفة والتي تستهدف علامات خاصة بالنخاع والأجسام المضادة الثانوية البيوتينيل.

إدخال بيروكسيداز مترافق بالستربتافيدين وتيراميد مترافق بالفلوروفور مختلف لتسمية النخاع.

إن تجريد الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالقشرة يمنع الأجسام المضادة الثانوية المعاد إدخالها ، مما يمنع التفاعل المتبادل.

ضع بقعة نووية وقم بإجراء التصوير لتصور القشرة والنخاع الملطخين بشكل واضح ، مما يؤكد عدم وجود تفاعل متبادل للأجسام المضادة.

قبل التلوين ، قم بإزالة الشمع وإعادة ترطيب الشرائح المثبتة بالفورمالين والمدمجة في البارافين مع غمر لمدة خمس دقائق في كل محلول كما هو موضح. بعد الغمر الثاني بالماء المقطر ، ضع الشرائح في 275 مل من محلول سترات الصوديوم المغلي في الجزء السفلي من صندوق طرف الماصة بغطاء ، وضع الصندوق في ميكروويف 700 واط بقوة 70٪ لمدة ثماني دقائق.

في نهاية العلاج ، افتح الغطاء واترك المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل غسل الشرائح بثلاث غسلات لمدة خمس دقائق من PBST الطازج في جرة كوبلين. لمنع أي مواقع ربط غير محددة ، بعد الغسيل الأخير ، قم بهز PBST الزائد من كل شريحة وقم بتغطية الشرائح بحجم كاف من محلول الحظر المناسب.

بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة ، رج محلول الحجب الزائد من كل شريحة ، وأضف 250 ميكرولترا من أول جسم مضاد أساسي محل اهتمام لكل عينة. لمنع جفاف العينات ، قد يتم تغطية الشرائح بقطعة من فيلم البارافين.

بعد حضانة ليلية عند أربع درجات مئوية في الغرفة المرطبة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBST طازج لمدة خمس دقائق لكل غسلة. تخلص من PBST الزائد ، ثم قم بتغطية كل شريحة بسرعة ب 250 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي المناسب لحضانة لمدة ساعة واحدة في الغرفة المرطبة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST طازج كما هو موضح ، وأضف 250 ميكرولترا من الستربتافيدين بيروكسيداز الفجل الطازج إلى كل شريحة. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST طازج ، ثم تخلص من PBST الزائد ، وقم بتغطية كل شريحة ب 250 ميكرولتر من محلول التيراميد الفلوروفوري المحضر حديثا.

بعد دقيقة واحدة ، اغمر الشرائح في PBST الطازج ، متبوعا بثلاث غسلات لمدة دقيقتين في PBST الطازج. بعد الغسيل الأخير ، ضع بضع قطرات من الجلسرين من 1 إلى 1 على محلول PBS على الأقسام ، وتحقق من وجود إشارة فلورية عن طريق المجهر الفلوري.

لتجريد مركب الأجسام المضادة الأول ، ضع الشرائح المسماة بالأجسام المضادة في 275 مل من محلول سترات الصوديوم المغلي لمدة ثماني دقائق على الأقل كما هو موضح. في نهاية العلاج ، افتح الغطاء واترك المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، قبل غسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

لتلطيخ البروتين المستهدف الثاني محل الاهتمام ، بعد إظهار الحجب للارتباط غير المحدد ، قم بتسمية كل عينة ب 250 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي الثاني ذي الأهمية عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في PBST طازج لكل غسلة قبل تغطية كل شريحة ب 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسب لحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST طازج كما هو موضح ، وأضف 250 ميكرولترا من الستربتافيدين بيروكسيداز الفجل الطازج إلى كل شريحة. لتطوير إشارة البروتين المستهدف الثاني ذي الأهمية بعد ثلاث غسلات PBST ، عالج الشرائح باستخدام تيراميد مترافق بالفلوروفور في طيف فلوري مختلف.

لإيقاف تطور إشارة التيراميد ، اغمر الشرائح في PBST ثم قم بتلطيخ العينات بصبغة نووية مناسبة.