التصوير المناعي المتعدد الإرسال لتحليل مجموعات الخلايا التائية المقاومة للعلاج المناعي

خذ تشريح أنسجة سرطان الخلايا الكلوية بالتبريد الذي يظهر خلايا CD8 + T المتسللة في بيئتها المكروية للورم.

عالجها بالأسيتون لإصلاح الأنسجة وتنفاذها. يغسل لإزالة الأسيتون الزائد.

أضف أفيدين لتشبع بيوتين الأنسجة الداخلية. بعد ذلك ، أضف البيوتين لمنع مواقع ربط أفيدين الجمودة ، مما يقلل من التفاعلات غير المحددة.

ضع مصلا يحتوي على الغلوبولين المناعي لمنع مستقبلات الخلايا المناعية ، مما يمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

أضف كوكتيلا أوليا للأجسام المضادة يستهدف CD8 ، وهي علامة الخلايا التائية السامة للخلايا ، و PD-1 و Tim-3 ، المستقبلات المثبطة التي يتم التعبير عنها بواسطة مجموعات الخلايا التائية CD8 + المقاومة للعلاج المناعي.

إدخال أجسام مضادة ثانوية مميزة تحمل علامة الفلوروفور تستهدف الأجسام المضادة ل CD8 و Tim-3.

أضف الأجسام المضادة الثانوية الحيوية التي تستهدف الأجسام المضادة ل PD-1 وارتباط ستربتافيدين مختلف المسمى بالفلوروفور بالبيوتين.

ضع وسيطا مثبتا يحتوي على صبغة على تلطيخ نوى الخلايا وضع غطاء للملابس.

احصل على صور مضان متعددة الأطياف لتحديد خلايا CD8 + T المتسللة للورم والمجموعات السكانية الفرعية المقاومة للعلاج المناعي التي تعبر عن PD-1 أو Tim-3 أو كليهما.

بعد الذوبان ، استخدم منشفة ورقية لتجفيف الشرائح بعناية حول أقسام الأنسجة ، وقم بتطويق الأنسجة بقلم حاجز كاره للماء. عندما يجف الحاجز ، قم بإصلاح العينات في الأسيتون بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق ، متبوعة بدقيقتين من التجفيف بالهواء. ثم اغسل الشرائح في TBS لمدة 10 دقائق.

عالج الشرائح مسبقا بثلاث قطرات من 0.1٪ أفيدين لمدة 10 دقائق في الظلام. بعد ذلك ، انقر أو انقر فوق الشرائح لتغطية الأنسجة بمحلول أفيدين. أضف ثلاث قطرات من البيوتين بنسبة 0.01٪ إلى كل عينة ، واضغط على البيوتين أو نقره عبر العينات ، متبوعا بغسل TBS ، كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، قم بمنع أي ارتباط غير محدد ب 100 ميكرولتر من مصل عادي 5٪ في TBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، اضغط على الشرائح لإزالة المصل الزائد ، واحتضان الشرائح في 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة. اغسل الشرائح التي تحمل علامة الأجسام المضادة في TBST لمدة 5 دقائق.

بعد التجفيف ، قم بتسمية الخلايا ب 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية ذات الأهمية لمدة 30 دقيقة في الغرفة المرطبة ، متبوعا بغسل لمدة 10 دقائق في TBS. احتضان الشرائح المسماة بالأجسام المضادة الثانوية المجففة ب 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الثلاثية محل الاهتمام لمدة 30 دقيقة ، متبوعا بغسل TBS نهائي لمدة 10 دقائق.

في نهاية الغسيل ، جفف الشرائح ، وقم بتركيب المناديل باستخدام وسيط التثبيت المكملة ب DAPI. بعد ذلك ، قم بتغطية كل شريحة بزلة غطاء ، واترك وسط التثبيت لمدة ساعتين على الأقل.

لمسح الشرائح ضوئيا، افتح برنامج المجهر، وقم بتحميل بروتوكول مسح الصور ضوئيا. قم بتحميل الشريحة الأولى على مرحلة المجهر. ثم في شريط التحكم، انقر فوق تعيين التعريض الضوئي، واضبط وقت التعريض الضوئي لكل مرشح حتى يتم الحصول على إشارة كافية ولكن غير مشبعة.

انقر فوق البدء في اللوحة العلوية، وافتح مجلد معرف المختبر. أدخل معرف الشريحة الأولى، ثم انقر فوق التالي.

للحصول على نظرة عامة على الشريحة تحت ضوء المجال الساطع بتكبير 4x، انقر فوق Monochrome Imaging (تصوير أحادي اللون) و"البحث عن عينة". لتحديد منطقة الأنسجة المراد مسحها ضوئيا، اضغط على مفتاح التحكم، واستخدم المؤشر لتحديد أو إلغاء تحديد المناطق ذات الاهتمام المراد مسحها ضوئيا عند التكبير 4x.

للحصول على صورة فلورية باللون الأحمر والأزرق والأخضر لكل منطقة، انقر فوق تصوير منخفض الطاقة. لتحديد المجال عالي الطاقة، اضغط على مفتاح التحكم، وحدد ما لا يقل عن خمس مناطق ذات أهمية تتوافق مع مناطق الأنسجة التي سيتم مسحها ضوئيا عند التكبير 20x.

بعد ذلك، للحصول على الحصول على صورة متعددة الأطياف لكل حقل، انقر فوق تصوير عالي الطاقة، وانقر فوق تخزين البيانات لتخزين الصور في مجلد معرف المختبر المناسب.