تقنية التألق المناعي لتوطين البروتين الفيروسي في الخلايا المصابة

ابدأ بشريحة تحتوي على خلايا مضيفة ملتصقة.

أضف الفيروسات واسمح لها بالدخول إلى الخلايا المضيفة.

قم بإزالة الوسط المستهلك. أضف وسيطا جديدا لتمكين تخليق البروتين الفيروسي ونقله.

استخدم بارافورمالدهيد للحفاظ على مورفولوجيا الخلية وموقع البروتين.

أضف جزيئات المنظفات لجعل الخلايا قابلة للنفاذ.

تطبيق مخزن مؤقت للحظر لحظر مواقع الربط غير المستهدفة.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي تربط البروتينات الفيروسية المستهدفة. إزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

تراكب مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور الأحمر لوضع علامات على البروتينات الفيروسية بالفلورسنت. إزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

أضف وسيط تركيب يحتوي على صبغة نووية فلورية لتلطيخ النوى.

باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، راقب موقع البروتينات الفيروسية ذات الفلورسنت الأحمر والنوى المضيفة الفلورية الزرقاء.

الإشارة الحمراء الأقوى حول المنطقة الزرقاء إلى توطين السيتوبلازم ، بينما تشير الإشارة الأقوى من الداخل إلى التوطين النووي.

تشير مستويات الإشارة المتساوية في المنطقة الزرقاء وحولها إلى أن البروتينات موجودة في كل من النواة والسيتوبلازم.

قبل 20 إلى 24 ساعة من الإصابة بالفيروس ، قم بزرع 5 × 10⁴ خلايا الخلايا الليفية الجنينية البشرية أو خلايا الخلايا الليفية HEL لكل بئر على شريحة متداخلة من 4 آبار 11 ملم في وسط النمو للحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

من المهم هز الشريحة جيدا لضمان التوزيع المتساوي للخلايا مع الحرص على تجنب انسكاب وسط الزراعة. في اليوم التالي ، استبدل المواد الطافية للثقافات المتقاربة بنسبة 70٪ إلى 80٪ ب Medium-199 التي تحتوي على 4-10 وحدات لتشكيل البلاك لكل خلية ، وضع الشريحة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة ساعة واحدة.

في نهاية الحضانة ، استبدل المواد الطافية بوسط نمو جديد ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة لفترة العدوى التجريبية المناسبة. بالنسبة لتلوين التألق المناعي للخلايا المصابة بالفيروس ، اغسل الخلايا بسرعة ثلاث مرات باستخدام PBS ، متبوعا بحضانة لمدة 8 إلى 10 دقائق في 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لكل بئر. في نهاية التثبيت ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS لكل غسلة وقم باختراق الخلايا ب 100 ميكرولتر من 0.2٪ خافض للتوتر السطحي غير أيوني لكل بئر لمدة 5 إلى 10 دقائق.

اغسل الخلايا المنفذة ثلاث مرات في PBS كما هو موضح ، وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب إلى كل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف التركيز المناسب للجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية لكل بئر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، قم بإزالة أي جسم مضاد أولي غير مرتبط بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في مخزن مؤقت جديد ، وأضف جسما مضادا ثانويا مناسبا لكل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في مخزن مؤقت مانع كما هو موضح ، متبوعا بغسل واحد في PBS ، وأضف قطرة واحدة من وسيط التثبيت المضاد للبهتان ، مع استكمال DAPI لكل بئر. ثم ضع غطاء فوق الشريحة ، وأغلق الغطاء بطلاء أظافر شفاف.

سيؤدي الضغط اللطيف أثناء تركيب الغطاء إلى إزالة أي وسيط تركيب زائد ، مما يساعد على ضمان الحصول على صور عالية الجودة.

لتحليل التوزيع النووي والسيتوبلازمي ل ICP0 ، افتح المشروع في برنامج التطبيق متحد البؤر وحدد صورة. افتح علامة التبويب الكمية وحدد فرز مناطق الاهتمام من القائمة أدوات. حدد رسم الخط، وارسم خطا طوليا عبر الخلية المراد تحليلها. سيظهر رسم بياني يوضح شدة التألق على طول الخط لكل من البروتين محل الاهتمام و DAPI.

بناء على تلطيخ الخلفية ، قم بإعداد عتبة ثابتة لشدة البروتين محل الاهتمام لتحليل التوزيع الخلوي للبروتين في كل تجربة. إذا كانت إشارة البروتين ، في المتوسط ، أقل من العتبة في المنطقة النووية ، ولكنها أعلى من العتبة خارج حدود DAPI ، فقم بتصنيف إشارة البروتين على أنها تقع في الغالب داخل السيتوبلازم.

إذا كانت إشارة البروتين أعلى من العتبة في جميع أنحاء النواة وخارج حدود إشارة DAPI ، فقم بتجميع إشارة البروتين كنواة بالإضافة إلى التوطين السيتوبلازمي. إذا كانت إشارة البروتين أعلى من العتبة في النواة ، ولكن في المتوسط كانت أقل من العتبة خارج حدود إشارة DAPI ، فقم بتجميع إشارة البروتين كتوطين نووي.