الكشف الكمي عن البكتيريا المتعددة باستخدام الكريات المجهرية المغناطيسية ذات العلامات الصبغية

خذ لوحة فحص تحتوي على خليط من كريات البوليسترين المغناطيسية المصبوغة داخليا بفلوروفورات مختلفة طيفيا.

تقترن كل مجموعة كرية تساهمية بأجسام مضادة خاصة بالبكتيريا المسببة للأمراض متميزة.

أضف خليطا بكتيريا مسببة للأمراض مقتولة بالحرارة. حضن.

تربط الأجسام المضادة الملتقطة المستضدات البكتيرية المستهدفة ، وتشكل مجمعات بكتيريا مجهرية.

استخدم فاصلا مغناطيسيا لتسوية المجمعات. تخلص من البكتيريا غير الملزمة واغسلها بالعازلة.

أضف الأجسام المضادة للكشف عن المخزن المؤقت والحيوي ، والتي ترتبط على وجه التحديد بالبكتيريا المرتبطة بالكرة المجهرية.

افصل المجمعات مغناطيسيا واغسلها بالعازلة.

قم بإعادة تعليق المجمعات في المخزن المؤقت. جزيئات مراسل الماصة التي تتكون من الستربتافيدين المقترن بالفلوروفور ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيل.

افصل مغناطيسيا واغسل المجمعات. إعادة التعليق في المخزن المؤقت.

أثناء التحليل القائم على التدفق ، يثير الليزر الأول الفلوروفورات الداخلية للكرة المجهرية ، مما يولد توقيعات طيفية فريدة ويحدد مجموعات الكرة المجهرية الفريدة.

يثير الليزر الثاني مراسلي الفلوروفور المرتبطين بالبكتيريا على الكريات المجهرية ، مما يؤدي إلى تحديد البكتيريا على مجموعات مجهرية مختلفة ، مما يتيح الكشف الكمي عن البكتيريا المتعددة.

لالتقاط العينات ، ابدأ بإضافة خمسين ميكرولترا من الكريات المجهرية ، أو الخرز المترافق لالتقاط الأجسام المضادة في صفيحة مكونة من 96 بئرا. ثم أضف خمسين ميكرولترا من البكتيريا المسببة للأمراض متبوعا بخمسين ميكرولترا من PBS-TBN في آبار الخلفية.

قم بتغطية اللوحة بختم لوحة رقائق معدنية واحتضانها على شاكر لوحة عند ثمانمائة دورة في الدقيقة لمدة ساعة.

بعد ذلك ، ضع اللوحة على الفاصل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة لفصل الخرز. قم بإخلاء المحلول المتبقي ، مع إبقاء اللوحة على فاصل اللوحة المغناطيسية. ثم اضغط لتجف على مناشف ورقية للمختبر ثلاث إلى أربع مرات. اغسل الآبار جيدا باستخدام PBS-TBN مرتين.

للكشف عن العينة ، أضف خمسين ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص متبوعا بخمسين ميكرولترا من الجسم المضاد للكشف عن البيوتينيل بتركيز أربعة ميكروغرام لكل مليلتر في الآبار.

احتضان اللوحة في الظلام لمدة ساعة للسماح بالتفاعل الفعال بين البكتيريا والأجسام المضادة للكشف. بعد ذلك ، افصل الخرزات باستخدام الفاصل المغناطيسي واغسل الخرزات باستخدام PBS-TBN ، كما هو موضح سابقا.

أعد تعليق الخرزات في خمسين ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص وأضف خمسين ميكرولترا من الستربتافيدين-R-phycoerythrin أو SAP ، وهو جزيء مراسل فلورسنت. قم بتغطية اللوحة بختم لوحة من رقائق الألومنيوم ، واحتضن على شاكر اللوحة لمدة 30 دقيقة.

بمجرد غسل الآبار ، أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من PBS-TBN وقم بتحميل اللوحة على المحلل القائم على التدفق.

سجل القراءات باستخدام البرنامج المناسب. يمكن تقييم صافي متوسط شدة التألق لكل كائن حي من خلال منحنى قياسي لتحديد الحمل البكتيري الموجود في العينة.