إجراء تلميح المرحلة لتحلية وتنقية الببتيدات

خذ STop And Go Extraction أو STAGE Tip ، وهو عمود تنقية مصغر.

يحتوي الطرف على حبات سيليكا صغيرة مرتبطة بسلاسل هيدروكربونية طويلة لتنقية الببتيد القائم على التفاعل الكارهة للماء.

يغسل بمخازن احتوائية تحتوي على نسبة عالية من الأسيتونيتريل ، وإزالة شوائب الراتنج.

أدخل عازلة ملزمة وطرد مركزي ، مما يؤدي إلى موازنة العمود لربط الببتيد الأمثل.

قم بتحميل عينة ببتيد مهضومة مسبقا تم الحصول عليها من خلايا شبيهة بالعدلات متمايزة ، تحتوي على شظايا وشوائب الببتيد ، بما في ذلك الأملاح.

جهاز طرد مركزي لتمرير العينة عبر العمود. ترتبط شظايا الببتيد بسلاسل الهيدروكربونات عبر التفاعلات الكارهة للماء ، بينما تتم إزالة الأملاح.

أضف المخزن المؤقت للربط وجهاز الطرد المركزي ، وإزالة الشوائب المتبقية.

أدخل المخزن المؤقت العالي المحتوي على الأسيتونيتريل للشطف.

باستخدام حقنة ، قم بتمرير المخزن المؤقت عبر العمود. يرتبط الأسيتونيتريل بسلاسل الهيدروكربونات ، مما يؤدي إلى إزاحة شظايا الببتيد التي تتدفق مع المخزن المؤقت.

إجراء التنميط البروتيني لتحديد الببتيدات المنقاة.

للبدء، قم بتعبئة ثلاث طبقات من راتنج C18 في طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لإنشاء طرف STop And Go Extraction أو STAGE لكل عينة من الببتيد.

أوقف الهضم الأنزيمي لعينات الببتيد المحتضنة مسبقا عن طريق إضافة 1 × 10 أحجام من محلول التوقف. قم بالطرد المركزي للعينات عند 13,200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 2 ملليلتر.

بعد ذلك ، اغسل أطراف STAGE ب 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل بنسبة 100 في المائة وأجهزة الطرد المركزي أطراف STAGE عند 1000 جم لمدة دقيقتين أو حتى يمر كل السائل عبر راتنج C18.

كرر غسل طرف STAGE ب 50 ميكرولتر من Buffer B متبوعا ب 200 ميكرولتر من Buffer A بنفس ظروف الطرد المركزي.

قم بتحميل العينات في أطراف STAGE لجهاز الطرد المركزي عند 1000 جم لمدة 3 إلى 5 دقائق. بعد ذلك ، اغسل أطراف STAGE ب 200 ميكرولتر من Buffer A عن طريق الطرد المركزي عند 1000 جم لمدة 3 إلى 5 دقائق.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من Buffer B إلى كل طرف STAGE ، وباستخدام حقنة ، قم بمسح العينات التي تحتوي على Buffer B في أنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر.

بمجرد أن يتم تصفية العينات ، جفف الببتيدات باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ لمدة 45 دقيقة. قم بتشغيل العينات على قياس الطيف الكتلي عالي الدقة مع الشروط الموضحة في المخطوطة النصية.

لمعالجة البيانات الخاصة بالتنميط البروتيني ، قم بتحميل ملفات البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من قياس الطيف الكتلي في برنامج MaxQuant. راجع المخطوطة النصية لجميع معلمات البرنامج وتعديلاته.

في المعلمات العالمية ، قم باستيراد ملف FASTA الخاص ب Homo sapiens لتحديد التسلسل الذي تم تنزيله من قاعدة بيانات Uniprot لتسجيل معرف الكائن الحي وعدد البروتينات وتاريخ تنزيل الملف.

قم بتعيين عدد مراكز الكمبيوتر للمعالجة وحدد ابدأ. عند الانتهاء من MaxQuant ، يتم إنشاء مجلد "مدمج" ، إلى جانب الملفات الأخرى اللازمة للتحميل إلى مستودعات البيانات.

لتحليل البيانات ، قم بتحميل "proteingroups.txt" في Perseus وحدد جميع ملفات القياس الكمي الخالية من الملصقات أو LFQ إلى النافذة "الرئيسية". قم بتصفية الصفوف عن طريق إزالة الملوثات والببتيدات العكسية والببتيدات التي تم تحديدها فقط بواسطة الموقع وتحويل البيانات عن طريق السجل₂ (x).

لمراقبة عدد البروتينات المكتشفة في كل نسخة مكررة ، قم بإنشاء مخطط Venn رقمي وقم بتعيين التعليقات التوضيحية الفئوية لكل عينة من خلال توفير نفس الاسم لجميع التكرارات لعينة بيولوجية واحدة.

قم بتصفية الصفوف بناء على قيمة صالحة مع البروتين المحدد في أكثر من 50 بالمائة من التكرارات وضمن مجموعة واحدة على الأقل. لاستبدال القيم المفقودة ل LFQ ، قم بإجراء التضمين من التوزيع العادي.

أضف معلومات التعليقات التوضيحية التي تم تنزيلها من موقع Perseus على الويب إلى صفوف البروتين عن طريق إضافة ملفات FASTA txt.gz في مجلدات "bin" و "conf" و "annotation". أحضر مصطلحات محددة مثل أسماء البروتينات وأسماء الجينات وأنطولوجيا الجينات.

اكتملت المصفوفة الآن ويمكن تصورها في أدوات مثل مخططات تحليل المكونات الرئيسية والخرائط الحرارية وإثراء الفئة. إجراء اختبار إحصائي لتحديد التغيرات الكبيرة في وفرة البروتين بين الظروف المختبرة.