تقييم الأجسام المضادة الوظيفية المعادلة ل SARS-CoV-2

ابدأ بمصل بشري مخفف بشكل متسلسل يحتوي على تركيزات متفاوتة من الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروس كورونا 2 أو SARS-CoV-2.

إدخال فيروسات ذات نمط كاذب مع الحمض النووي الريبي لوسيفيراز ، والإنتجاراز ، والنسخ العكسي ، مغلفة داخل طبقة ثنائية دهنية تحتوي على بروتينات سبايك SARS-CoV-2.

الأجسام المضادة على تحييد الفيروسات بناء على تخفيف المصل ، مع إظهار التخفيفات المنخفضة أقصى قدر من التحييد.

إدخال الخلايا المستهدفة التي تعبر عن مستقبلات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين -2 أو مستقبلات ACE2 والبروتياز عبر الغشاء سيرين -2 أو TMPRSS2.

في عمليات تخفيف المصل العالية ، تتفاعل الفيروسات غير المعادلة مع مستقبلات ACE2 ، بينما تشق TMPRSS2 بروتين السنبلة ، مما يتيح اندماج الفيروسات.

عند الدخول ، يتم نسخ الحمض النووي الريبي لوسيفيراز عكسيا إلى الحمض النووي الذي يندمج في جينوم المضيف وينتج إنزيم لوسيفيراز.

استبدل الوسط بمخزن مؤقت للفحص يحتوي على ركيزة لوسيفيراز وعامل تحلل.

تحلل الخلايا ، وتطلق لوسيفيراز داخل الخلايا ، والذي يتفاعل مع الركيزة وينتج لمعانا عاليا.

قم بتحديد اللمعان عبر تخفيفات المصل لتحديد نسبة تحييد الفيروس - يمثل التخفيف الذي يحقق تحييدا خمسين بالمائة عيار التحييد.

للبدء ، أضف 50 ميكرولترا من DMEM مع 10 في المائة FBS و 1 في المائة من البنسلين الستربتومايسين إلى الصفوف من B إلى H ، الأعمدة من 1 إلى 12 من صفيحة بيضاء مكونة من 96 بئرا.

أضف 5 ميكرولتر من مصل النقاهة في آبار الصف A ، الأعمدة من 2 إلى 10 ، بحجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر DMEM مع 10 في المائة FBS و 1 في المائة من البنسلين - الستربتومايسين. أضف 5 ميكرولترات من الأمصال الإيجابية والسالبة في الآبار A11 و A12 كضوابط.

قم بإزالة 50 ميكرولترا من المحلول من آبار الصف A وقم بإجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة لجميع الآبار الموجودة تحته. لكل تخفيف، استخدم ماصة متعددة القنوات لخلط المحاليل من 5 إلى 10 مرات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل دون تكوين فقاعات هواء.

بعد الانتهاء من التخفيف التسلسلي ، تخلص من آخر 50 ميكرولترا من آخر بئر لكل عمود.

بالطرد المركزي للوحة لمدة 1 دقيقة بمعدل 500 دورة في الدقيقة لضمان عدم ترك أي سائل على جدران البئر. احسب كمية DMEM المطلوبة لتخفيف SARS-CoV-2 PV كما هو موضح في المخطوطة النصية.

امزج المحلول الكهروضوئي المخفف في حوض ماصة وقم بكمية 50 ميكرولتر في كل بئر، باستثناء الآبار من A6 إلى A12 التي تشتمل على التحكم الخلوي فقط. تعمل الآبار من A1 إلى A6 كتحكم كهروضوئي فقط.

لوحة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بمعدل 500 دورة في الدقيقة لضمان عدم ترك أي فيروس على جدران البئر. بعد ذلك ، قم باحتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة للسماح للمصل بالارتباط بالبروتين السكري SARS-CoV-2.

بعد ذلك ، قم بإعداد صفيحة من الخلايا المستهدفة HEK 293T / 17 التي تم نقلها قبل 24 ساعة باستخدام ACE2 و TMPRSS2 البلازميدات. قم بإزالة وسائط الثقافة من الطبق ، واغسلها مرتين باستخدام 2 مل من PBS ، عن طريق إضافتها إلى جانب واحد من الطبق لتجنب انفصال الخلايا.

تخلص من PBS وأضف 2 مل من التربسين إلى الطبق. ضع الطبق في حاضنة حتى يتم فصل الخلايا.

بعد انفصال الخلايا ، أضف 6 ملليلتر من DMEM مع 10 في المائة FBS و 1 في المائة من البنسلين - الستربتومايسين إلى اللوحة لإخماد نشاط التربسين ، وإعادة تعليق الخلايا برفق.

عد الخلايا باستخدام عداد خلوي آلي أو عن طريق عد شريحة الغرفة. أضف 1 × 10⁴ خلايا مقسمة بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر لكل بئر واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة وسائط الاستزراع من جميع الآبار ، وأضف 25 ميكرولترا من مزيج 1: 1 من PBS وكاشف فحص لوسيفيراز تجاري. اقرأ اللوحة باستخدام نظام فحص لوسيفيراز تجاري مع مقياس إضاءة ميكروليست.

باستخدام البيانات الأولية التي تم إنشاؤها بواسطة مقياس الإضاءة ، احسب عيارات الأجسام المضادة المعادلة IC50 كما هو موضح في المخطوطة النصية.