قياس مستويات الغلوبولين المناعي G مقابل لقاح اختبار في مصل الفأر

ابدأ بلوحة متعددة الآبار مغطاة بلقاح اختبار وحظر مواقع التفاعل غير المحددة.

الحصول على عينة مصل من فأر محقون باللقاح الاختباري.

يحتوي

هذا المصل على الأجسام المضادة للغلوبولين المناعي G ، أو IgG ، التي تتعرف على لقاح الاختبار.

إلى الآبار المغلفة باللقاح ، أضف عينات المصل المخففة بشكل متسلسل.

ترتبط IgGs باللقاح. يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

أضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع البيروكسيديز التي ترتبط ب IgGs. إزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة.

أضف ركيزة كروموجينيك. يتفاعل البيروكسيديز مع الركيزة ، مما يولد منتجا أزرق اللون.

أدخل حمضا لإيقاف التفاعل. التغيير في الأس الهيدروجيني يحول المحلول إلى اللون الأصفر.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس كثافة اللون لكل بئر لتحديد تركيز IgG في عينة المصل.

بالنسبة لطلاء المستضد لمقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، أو لوحة ELISA ، قم بتخفيف مستضد بروتين HI إلى 10 ميكروغرام لكل مليلتر بمحلول طلاء ، وأضف 100 ميكرولتر من المستضد المخفف لكل بئر في لوحة ELISA. احتضن الطبق عند 4 درجات مئوية طوال الليل. بعد الحضانة ، اغسل الطبق ب 300 ميكرولتر من PBST لكل بئر.

أغلق الآبار ب 300 ميكرولتر من محلول الختم لكل بئر لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتخفيف ثلاثة ميكرولترات من مصل الفئران من كل مجموعة تجريبية 100 مرة عن طريق إضافة 297 ميكرولتر من PBST ، ودوامة المصل المخفف. أضف 100 ميكرولتر من المصل المخفف لكل بئر في صفيحة ELISA المطلية لكل عينة مصل. وبالمثل ، قم بتخفيف أمصال التحكم الإيجابية والسلبية 100 مرة باستخدام PBST ، عن طريق إضافة 4 ميكرولتر من مصل التحكم الإيجابي أو السلبي إلى 396 ميكرولتر من PBST متبوعا بخلط دوامة.

لإجراء التخفيف المزدوج النسبة ، أضف 200 ميكرولتر من المصل التجريبي المخفف مسبقا إلى الصف الأول من لوحة ELISA المطلية. ثم أضف 100 ميكرولتر من PBST إلى جميع الآبار ، باستثناء تلك الموجودة في الصفين الأول و 12. بعد ذلك ، اضبط مسدس الماصة على 100 ميكرولتر وانقل 100 ميكرولتر من المصل من الصف الأول إلى الصف الثاني الذي يحتوي على PBST.

امزج المحتوى في الصف الثاني 10 مرات باستخدام مسدس الماصة. وبالمثل ، قم بإجراء 1: 2 تخفيفات متتالية من المصل حتى الصف 11. بمجرد الانتهاء من ذلك ، تخلص من 100 ميكرولتر من السائل من الصف 11.

أضف 100 ميكرولتر من المصل السلبي والموجب المخفف إلى كل بئر مقابل في الصف 12 ، باتباع نموذج العينة. أغلق لوحة ELISA بغلاف بلاستيكي واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وفي الوقت نفسه ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر IgG HRP 10,000 مرة عن طريق إضافة PBST. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، اغسل لوحة ELISA ب 300 ميكرولتر من PBST لكل بئر لتنظيف الأجسام المضادة غير المرتبطة. ثم أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.

اغسل الطبق ب 300 ميكرولتر من PBST لكل بئر. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول تطوير ألوان TMB إلى كل بئر. ضع الأطباق على حرارة 37 درجة مئوية وبعيدا عن الضوء لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإنهاء التفاعل على الفور باستخدام 50 ميكرولتر من 2 حمض الكبريتيك المولاري. اكتشف الكثافة الضوئية أو قيم OD عند 450 نانومتر ، باستخدام علامة إنزيم في غضون 15 دقيقة بعد الإنهاء.