تقييم الانقسام بوساطة كاسباز للبروتينات الفيروسية والمضيفة في الخلايا المصابة بالفيروس

ابدأ بخلايا الثدييات المصابة بالفيروس والتي تنتج كاسباسات متعددة ، بما في ذلك كاسباز 3.

أضف وسط نمو إلى بئر التحكم ووسط مكمل بمثبطات كاسباز 3 إلى بئر الاختبار.

في بئر التحكم ، يتعرف كاسباز -3 على البروتينات النووية الفيروسية والبروتينات المضيفة اللازمة لانتشار الفيروس ويحللها.

في بئر الاختبار ، يدخل المثبط إلى الخلية ، مما يثبط نشاط كاسباز 3 ويمنع تدهور البروتين.

إزاحة الخلايا من اللوحة. أضف كاشف التحلل والحرارة للحث على تحلل الخلايا ، وإطلاق البروتينات داخل الخلايا.

قم بتحميل كلتا العينتين على جل SDS-polyacrylamide و electrophorese لفصل البروتينات بناء على الحجم.

بعد الرحلان الكهربائي ، انقل الجل إلى غشاء نشاف.

عالج الغشاء بالأجسام المضادة الأولية ضد البروتينات النووية الفيروسية والبروتينات المضيفة.

اغسل وتراكب بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور المرتبطة بالأجسام المضادة الأولية ، مما يؤدي إلى توليد نطاقات الفلورسنت.

يشير التألق العالي في عينة الاختبار إلى انخفاض الانقسام الفيروسي والبروتين المضيف بوساطة كاسباز -3 مقارنة بالسيطرة.

للبدء ، قم ببذور خلايا MDCK أو A549 في صفيحة زراعة خلية مكونة من 12 بئرا ، باحتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية تحت جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط الثقافة القديم من الخلايا واغسل الخلايا في كل بئر مرتين باستخدام 1 مليلتر من MEM الخالي من المصل.

ثم قم بإصابة الخلايا بإضافة 400 ميكرولتر من لقاح فيروس الأنفلونزا A ووضع الصفيحة للحضانة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، قم بإزالة لقاح الفيروس وغسل الخلايا باستخدام MEM. أضف 1 مليلتر من MEM الخالي من المصل إلى كل بئر ، واحتضن الخلايا كما هو موضح في الخطوة السابقة.

بعد 24 ساعة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق كشطها باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مليلتر ، ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 12,000 جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، واجمع المادة الطافية. اغسل حبيبات الخلية ب 250 ميكرولتر من المحلول الملحي وأجهزة الطرد المركزي المخزنة بالفوسفات. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل الخلايا. امزج عن طريق الدوامة.

قم بتسخين الأنبوب عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتحلل الخلايا تماما. بعد ذلك ، قم بحل كميات متساوية من البروتين من العينات غير المصابة والمصابة عن طريق الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS القياسي. بعد الرحلان الكهربائي ، انقل هلام البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز أو PVDF وقم بإجراء النشاف الغربي. قارن مستويات البروتين في ممرات العينة المصابة المعالجة بالوهمية والمعالجة بالمثبطات.