اختبار لقياس تراكم مسبار مضاد حيوي فلوري في الخلايا البكتيرية

خذ أنابيب الفحص التي تحتوي على عينات بكتيرية.

في عينة الاختبار ، أضف جزيئات مثبطة لمنع مضخة تدفق المضادات الحيوية للبكتيريا.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية.

أضف مجسات المضادات الحيوية المترافقة بالفلوروفور التي تدخل الخلايا البكتيرية.

في عينة التحكم ، تقوم مضخة التدفق ببثق المجسات في الوسط خارج الخلية.

في العينة المعالجة بالمثبط ، لا تستطيع مضخة التدفق المسدودة طرد المجسات ، مما يتسبب في تراكمها.

الطرد المركزي العينات. تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على مجسات خارج الخلية.

أضف المخزن المؤقت للتحلل متبوعا بالليزوزيم لإضعاف جدار الخلية البكتيرية.

أداء دورات التجميد والذوبان ، والصوتنة ، والتعرض لدرجات الحرارة العالية لتحلل الخلايا.

الطرد المركزي. انقل المادة الطافية إلى غشاء مرشح.

اغسل واجمع المرشح الذي يحتوي على المجسات.

قياس شدة مضان المرشح.

تشير

شدة التألق الأعلى في العينات البكتيرية المعالجة بالمثبطات إلى فقدان وظيفة التدفق ، مما يؤدي إلى تراكم المسبار داخل الخلايا.

لتحليل تراكم المسبار ، قم بتجميع مخزونات الجلسرين من السلالات البكتيرية على ألواح أجار LB لحضانة ليلية عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، اختر مستعمرة واحدة من الطبق للاستزراع بين عشية وضحاها في مرق ليزوجيني عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافة الليلية بحوالي 50 ضعفا في وسط جديد.

عندما تصل الثقافة إلى مرحلة منتصف السجل ، قم بتكسير البكتيريا عن طريق الطرد المركزي ، وصب الوسط. إعادة تعليق البكتيريا في 1 ملليلتر من PBS ، والطرد المركزي للبكتيريا مرة أخرى. صب المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات المغسولة في PBS إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من اثنين.

أضف 10.1 ميكرولتر من 10 ملليمولار CCCP في PBS إلى 1 مليلتر من البكتيريا ، واحتضان البكتيريا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، اجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من محلول مضاد حيوي فلوري ميكرومولار من 10 إلى 100 ميكرومولار في PBS.

بعد حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، اغسل الخلايا بالطرد المركزي أربع مرات في 1 مليلتر من PBS البارد لكل غسلة. بعد الغسيل ، قم بتحلل البكتيريا ب 180 ميكرولتر من محلول التحلل ، و 70 ميكرولتر من الليزوزيم.

بعد 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، قم بتجميد البكتيريا وإذابتها ثلاث مرات عند 78 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 5 دقائق و 34 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على التوالي. بعد الجولة الأخيرة من التجميد والذوبان ، قم بصوتنة العينة لمدة 20 دقيقة ، تليها حضانة لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة ، اجمع العينة المحللة عن طريق الطرد المركزي ، وقم بتصفية محتويات الأنبوب من خلال غشاء مرشح 10 كيلودالتون. اغسل الفلتر أربع مرات ب 100 ميكرولتر من الماء لكل غسلة ، وقم بتقسيم كل غسلة في آبار فردية من صفيحة سوداء مسطحة القاع 96 بئرا. ثم قم بقياس شدة التألق على قارئ اللوحة بأطوال موجية للإثارة والانبعاث المناسبة للفلوروفور.